七叶亭调控Th1／Th2失衡对过敏性哮喘小鼠的抗哮喘作用

李 镇 ，陈 亮 ，林敬明 ，卓 越 ，江朝娜

（1.海南省第三人民医院呼吸内科，海南 三亚 572000； 2.海南医学院形态学实验室，海南 海口 571199）

过敏性哮喘是以气道炎症、气道高反应性（AHR）和可逆性气道阻塞为特征的气道慢性炎症性疾病，其病理特征包括炎症细胞充盈、水肿，肥大细胞活化、气道上皮细胞剥落和胶原沉积[1]。过敏性哮喘与CD4+T淋巴细胞亚群-辅助性T细胞1（Th1）／Th2及其特有的细胞因子的失衡密切相关[2]。Ⅰ型过敏是由对过敏原的特异性免疫反应引起的，主要由Th2细胞介导[3]。Th2细胞合成高水平的白细胞介素4（IL-4）、IL-5和 IL-13，导致过敏原特异性免疫球蛋白E（IgE）的释放和肥大细胞介质的产生[4]。此外，诱导组胺和白三烯释放的Th2细胞因子与 AHR 相关[5]。与 Th2细胞相比，干扰素 γ（IFN-γ）、IL-12等Th1细胞因子参与拮抗Th2细胞反应和IgE合成，抑制过敏性哮喘的进展[6]。近年来，抑制Th2细胞活化和调节Th1／Th2平衡来预防和治疗哮喘受到关注[7]。七叶亭是天然药物秦皮的有效活性成分，具有抗炎和调节免疫等多种药理作用[8]。本研究中探讨了七叶亭对过敏性哮喘小鼠的治疗作用及对Th1／Th2细胞因子的影响，为其用于防治过敏性哮喘提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：GYD-003型大小鼠肺功能检测仪（法国Emka公司）；组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备（德国Leica公司）；Sunrise型全自动酶标仪（瑞士Tecan公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

试药：七叶亭（浙江省湖州市之江有限公司，纯度大于98%，批号为Z5250）；地塞米松磷酸钠注射液（河南科伦药业有限公司，批号为 13011911）；卵白蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶（美国 Sigma公司，批号分别为118K7002，MKBC0623）；醋甲胆碱（美国 Sigma 公司，批号为118K7028）；苏木素染色液（上海碧云天生物技术研究所，批号为 C0107）；IFN-γ，IL-4和IgE酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒（上海酶联生物科技有限公司 ，批 号 分 别 为 mL063160，mL076941，mL059784）；CD3-APC，CD4-FITC，IFN-γ 抗体和 IL-4抗体（美国 BD公司，批号分别为 BD003-1-2，BD001-3-2，BD005-1-2，BD004-1-1）。

动物：C57BL／6小鼠购于河北医科大学实验动物中心，许可证号为SCXK（冀）2012-0002。

1.2 动物分组、模型制备与给药

选 60只体质量 25～30 g的雄性 C57BL／6小鼠，在SPF环境中自由进食和饮水，适应性喂养1周后。根据随机数字表法将小鼠均分为对照组(A组)，模型组(B组)，地塞米松组(C组)和七叶亭低、中、高剂量组(D1，D2，D3组)，各10只。采用OVA联合氢氧化铝凝胶多次激发致敏法造模[9]。致敏阶段：在实验第1，8，15天对B组、C 组和 D1，D2，D3组小鼠腹腔注射 2%OVA 1 mL 和氢氧化铝凝胶（200 ng／mL）1 mL；激发阶段：在实验第25～29天用雾化器泵入 1%OVA 溶液（0.2 mL），每日1次，持续5 d。A组用生理盐水替代OVA和氢氧化铝凝胶，其他操作相同。药物干预：在第16～29天（连续14 d）D1，D2，D3组小鼠腹腔注射七叶亭（100，200，400 mg／kg），C 组小鼠腹腔注射地塞米松（1.25 mg／kg），作为阳性对照，A组和B组小鼠腹腔注射生理盐水。末次给药24 h后，处死小鼠。

1.3 观察指标

气道反应性测定：末次给药24 h后，麻醉小鼠并固定，暴露气管，在气管上剪1个小口，插入插管并固定，连接小鼠肺功能仪。给予不同浓度的醋甲胆碱，记录各组小鼠气道阻力值。

病理学检查：气道反应性测定结束后，分离肺组织，右肺上叶用甲醛固定，经脱水、包埋、切片（3 μm），用苏木精-伊红（HE）染色，观察肺组织的病理改变。

ELISA法检测 IFN-γ，IL-4和 IgE含量：结扎左侧主支气管近端和气管远端，在气管结扎下端用0.3 mL预冷0.9%氯化钠注射液进行左肺灌洗，重复3次，回收支气管肺泡灌洗液，离心，取上清液，根据试剂盒说明书检测支气管肺泡灌洗液中IFN-γ，IL-4，IgE的含量。

流式细胞术检测Th1和Th2细胞：无菌取出脾脏，置含RPMI-1640培养基的EPP管中，制备单细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔200 μL，与乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA，50 ng ／mL）和离子霉素（1 g／L）在 5%CO2培养箱中孵育5 h。然后用抗小鼠CD3和CD4抗体，在4℃下标记细胞30 min。将细胞固定在Perm／Wash缓冲液中，在黑暗中透化 20 min，加入 IFN-γ和IL-4抗体，4℃孵育30 min，采用流式细胞仪检测染色的细胞。

1.4 统计学处理

2 结果

结果见表1至表3和图1至图3。小鼠肺组织病理学检查显示，A组肺组织炎性细胞较少；B组肺组织中炎性细胞明显浸润支气管周和血管周结缔组织，主要为白细胞浸润，且大多数白细胞是嗜酸性粒细胞；给予地塞米松和七叶亭后，与B组相比，炎性细胞浸润明显减弱；C组和D3组作用相似(见图1)。

3 讨论

过敏性哮喘是儿童和成人最常见的慢性呼吸道疾病，迄今已有多种治疗过敏性哮喘的药物如地塞米松、白三烯抑制剂、肥大细胞稳定剂和β2肾上腺素能受体激动剂，但仅能对症治疗，长期服用可能产生较严重的不良反应[10]。亚洲许多国家常用中草药来治疗过敏性哮喘，但尚不清楚其治疗功效和作用方式[11]。本研究中，七叶亭作用于过敏性哮喘小鼠模型有效。

表1 不同醋甲胆碱质量浓度下各组小鼠气道阻力值变化比较[±s，cmH2O ／(s·mL)]

表1 不同醋甲胆碱质量浓度下各组小鼠气道阻力值变化比较[±s，cmH2O ／(s·mL)]

注：与 A 组比较，aP ＜0.05；与 B 组比较，bP ＜0.05；与 C 组比较，cP ＜0.05；与 D1组比较，dP ＜0.05；与 D2组比较，eP ＜0.05。下表同。

醋甲胆碱(m g／m L)组别0 A组B组C组D 1组D 2组D 3组1.8 2 ± 0.3 1 1.9 8 ± 0.4 2 1.7 5 ± 0.4 8 1.9 0 ± 0.6 3 1.7 9 ± 0.5 2 1.9 8 ± 0.2 7 3.1 2 5 2.5 0 ± 0.6 4 2.7 7 ± 0.9 9 2.9 6 ± 1.3 4 2.9 6 ± 0.4 8 2.8 3 ± 0.6 0 2.7 9 ± 0.9 2 6.2 5 5.7 3 ± 0.4 2 6.7 1 ± 1.1 0 6.1 6 ± 0.6 8 6.6 2 ± 0.7 4 6.3 7 ± 1.8 9 6.2 5 ± 1.2 5 1 2.5 8.3 6 ± 0.3 7 1 4.5 1 ± 1.0 2 a 1 0.4 2 ± 1.7 4 ab 1 3.8 9 ± 2.8 9 ac 1 2.6 3 ± 0.3 7 abcd 1 0.3 3 ± 1.8 5 abde 2 5 1 1.8 4 ± 1.4 0 1 6.9 2 ± 2.7 2 a 1 3.2 2 ± 1.6 3 ab 1 5.2 7 ± 0.4 7 abc 1 4.4 2 ± 0.8 4 abcd 1 3.2 8 ± 0.2 5 abde

表2 各组小鼠肺泡灌洗液中IFN- ，IL-4，IgE含量比较（±s，pg ／mL）

表2 各组小鼠肺泡灌洗液中IFN- ，IL-4，IgE含量比较（±s，pg ／mL）

组别A组B组C组D1组D2组D3组IFN-68.38 ± 4.59 24.47 ± 5.28a 52.63 ± 6.14ab 30.73 ± 3.91abc 41.82 ± 4.34abcd 51.78 ± 5.69abde IL-4 58.50 ± 6.64 94.57 ± 7.36a 62.26 ± 3.90ab 88.85 ± 4.07abc 75.87 ± 3.94abcd 63.84 ± 5.15abde IgE 0.07 ± 0.02 0.32 ± 0.06a 0.13 ± 0.03ab 0.25 ± 0.05abc 0.19 ± 0.04abcd 0.14 ± 0.02abde

表3 各组小鼠脾脏CD4+T细胞中Th1和Th2细胞百分率比较（±s）

表3 各组小鼠脾脏CD4+T细胞中Th1和Th2细胞百分率比较（±s）

组别A组B组C组D 1组D 2组D 3组C D 4+I F N- +（% ）2.4 2 ± 0.1 6 0.9 8 ± 0.1 0 a 1.7 4 ± 0.1 4 ab 1.1 2 ± 0.0 8 abc 1.4 6 ± 0.1 1 abcd 1.7 6 ± 0.5 1 abde C D 4+I L-4+（% ）2.2 1 ± 0.2 1 5.4 6 ± 0.3 2 a 2.7 1 ± 0.4 0 ab 4.2 5 ± 0.5 3 abc 3.9 4 ± 0.4 6 abcd 2.7 8 ± 0.6 8 abde T h 1／T h 2 1.1 5 ± 0.1 8 0.1 8 ± 0.0.0 4 a 0.6 5 ± 0.0 8 ab 0.2 4 ±0 0 4 abc 0.3 7 ± 0.0 4 abcd 0.6 2 ± 0.1 7 abde

气道炎性细胞浸润和AHR是过敏性哮喘的特征，AHR是通常在哮喘患者中观察到的支气管收缩的量度，由于气道平滑肌（ASM）收缩或肥大引起的支气管收缩和气道炎症可导致肺功能下降[12]。在给予醋甲胆碱质量浓度为 12.5 mg／mL和 25 mg／mL时，B组小鼠气道阻力高于A组，用地塞米松和不同剂量的七叶亭干预可降低气道阻力，且C组和D3组降低气道阻力的效果相当。结果表明，吸入醋甲胆碱后七叶亭可抑制OVA诱导的AHR。

图1 各组小鼠肺组织病理变化

炎性细胞及细胞因子参与过敏性哮喘的发生，特别是嗜酸性粒细胞和淋巴细胞向肺的迁移是过敏性气道炎症发生的主要原因[13]。组织病理学研究结果显示，七叶亭治疗显著减少了肺组织中白细胞浸润和嗜酸性粒细胞浸润。嗜酸性粒细胞调节树突状细胞和T淋巴细胞介导的依赖过敏原的Th2免疫应答，并减弱Th1应答[14]。在生理条件下，Th0细胞按比例分化为Th1和Th2细胞，且数量保持相对动态平衡。这种平衡一旦被打破，疾病就会发生。据报道，过敏性哮喘患者存在Th1／Th2细胞失衡[15]。Th1／Th2比值的变化被证实是哮喘增加气道炎症的一个初始因素，如能逆转Th1／Th2细胞的不平衡状态，就有可能成为哮喘治疗的潜在有益药物。Th2细胞合成高水平的IL-4，IL-5，IL-13，导致IgE的产生和肥大细胞释放介质，诱导气道炎性反应，如炎性细胞浸润、嗜酸性粒细胞活化、黏液高分泌[16]。IFN-γ和IL-12参与拮抗Th2细胞反应和IgE合成，抑制哮喘的进展[17]。IgE是影响制订抗哮喘策略的关键靶点，是引起过敏反应进展的重要因素之一。既往研究表明，抗IgE治疗可能对过敏性疾病有效[18]，故推测IgE的产生和Th1／Th2细胞因子平衡是评价抗过敏性哮喘作用的重要指标。Rb1显著抑制细胞因子IL-4和IgE水平，增加IFN-γ水平，恢复Th1／Th2比值接近正常水平，提示七叶亭可恢复哮喘患者Th1／Th2细胞的平衡。

图2 各组小鼠脾脏中CD4+IFN- +细胞百分率比较

图3 各组小鼠脾脏中CD4+IL-4+细胞百分率比较

气道炎症是由复杂的相互连接的信号网络调控的，与哮喘相关的气道炎症的确切分子机制仍有待阐明。已经证实信号传导及转录激活蛋白4（STAT4）和STAT6的活化在Th0细胞沿Th1和Th2通路的分化中起关键作用[19]。STAT6信号通路主要由IL-4诱导，IL-4诱导STAT6转位至细胞核，快速诱导 GATA-3的表达。GATA-3的表达是诱导转录因子c-MAF，是一种有效的IL-4基因特异性激活剂。这形成了IL-4诱导GATA转录因子3（GATA3）和Th2分化的正反馈回路[20]。而STAT4信号通路主要由IL-12诱导，STAT4的激活诱导 T-bet表达，T-bet通过染色质重构激活IFN-γ基因，分泌IFN-γ，增加IL12Rb2链的表达，进一步增强IL-12信号[21]。STAT4／6信号通路的失调参与变应性哮喘的发生，在变应性哮喘进展的控制中有重要作用，具有作为治疗干预靶点的潜力。但本研究中未对七叶亭治疗过敏性哮喘具体分子机制进行研究，将在后续研究中完善。

综上所述，七叶亭能减轻过敏性哮喘小鼠气道阻力和气道炎症，通过抑制IL-4、改善IFN-γ来调控Th1／Th2失衡，进而改善过敏性哮喘的进展，可作为过敏性哮喘患者的潜在免疫治疗药物，但仍需进一步研究七叶亭治疗过敏性哮喘的分子机制。