微重力条件对小球藻固碳能力与油脂积累的影响

杨 枭， 张志忍， 汪铁林，2， 王为国，2， 王存文，2

（1. 武汉工程大学 化工与制药学院， 湖北 武汉 430205； 2. 武汉工程大学 绿色化工过程教育部重点实验室，湖北 武汉 430205）

0 引言

由于人类活动和工业化所产生的温室气体，特别是二氧化碳（CO2），一直被认为是导致全球气候变化的主要原因[1]。 在可预见的未来，人类的能源供应仍将以传统化石燃料为主，因此，如何从CO2大型排放源中对CO2进行捕集与利用成为一个研究热点。CO2的捕集包括物理、化学和生物方法。 在生物方法中，微藻因为具有较高的固碳和产脂能力而受到了广泛的关注[2]。 在微藻固碳过程中，水和CO2转化为有机物，不会产生二次污染，同时，微藻中积累的脂质可作为生产第三代生物柴油的原料[3]，[4]。

微藻通常具有较好的CO2耐受性，这个特性使其有可能直接从烟道气中捕获CO2[5]。当环境中CO2的体积分数超过2%~5%时，通常会对大多数光自养生物的生长和光合作用产生不利影响，而有些微藻却对高浓度的CO2表现出很好的耐受性[6]。 虽然烟道气中一般含有10-4~3×10-4的NOx和SOx， 但是，有研究表明，少量的NOx对微藻的生长无显著影响， 微藻培养前在培养基中加入CaCO3可以消除SO2对微藻生长的影响[7]。 因此，利用燃煤烟气中的CO2培养能源微藻是可行的。

有研究表明，在微重力环境下，植物细胞的分裂能力增强，微藻细胞的代谢活动有明显变化。G Wang 通过研究发现，在微重力条件下，微藻的生长速度高于普通环境[8]。 因此，在微重力条件下培养微藻， 有望提高微藻的固碳能力和脂质的积累。本文以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）为研究对象，研究了在模拟的微重力条件下，高浓度的CO2对蛋白核小球藻生长和脂质积累的影响，并对其脂肪酸组成进行了分析。

1 材料和方法

1.1 藻种和培养条件

本研究所使用的蛋白核小球藻 （编号为FACHB-9） 由中国科学院水生生物研究所提供，培养基为BG-11。 实验在恒温（25±1 ℃）培养箱中进行，光照强度为4 000 lx，光暗比为16 h∶8 h。

1.2 模拟微重力系统

采用The Rotary Cell Culture System（RCCS）模拟微重力环境[9]。 RCCS 的转盘直径为8 cm，转速为10 r/min。 为了能够连续通入CO2，对RCCS 进行了改装（图1）。 气体先通入吸收池内的藻液，再通过蠕动泵将藻液送入转盘中。 蠕动泵的流量应严格控制，防止剪切力过大破坏FACHB-9 细胞。实验表明， 在同样的培养条件下，FACHB-9 在改装前后的RCCS 中的生长无显著差异。

图1 微藻培养系统原理图Fig.1 Schematic diagram of the microalgae culture system

在4 种不同的条件下对FACHB-9 进行培养，初始生物量浓度均为0.343 g/L。 其中两组在微重力条件下培养，一组通入CO2（记为SMGC），另一组通入空气 （记为SMG）； 余下两组为对照组，在普通条件（转盘静置）下培养，其中一组通入CO2（记为GCC），另一组通入空气（记为GC）。

1.3 微藻生物量浓度的测定

藻液的pH 值采用PHS-3C 型pH 计测定。通过UV-9000 型紫外可见分光度计在680 nm 下测定藻液的吸光度（OD680），微藻生物量浓度W（g/L）的计算式为

1.4 脂质提取及细胞形态观察

将培养所得藻液经4 000 r/min 离心10 min后，弃去上清液，取下层沉淀冷冻干燥至恒重，得到干燥藻粉。 采用甲醇-氯仿法从藻粉中提取油脂，将所提取的油脂转移到硫酸和甲醇（体积比为1∶7）混合溶液中并于50 ℃下反应24 h，再用正己烷萃取反应产物（脂肪酸甲酯）。 所得脂肪酸甲酯用饱和NaCl 溶液洗涤3 次， 并用无水Na2SO4干燥后由Agilent 7890A 型气相色谱-质谱 （GCMS）分析其组成。

将藻液稀释后用JSM-5510LV 型扫描电镜（SEM）观察微藻细胞的形态结构，并测定微藻细胞的平均直径。

1.5 油脂积累速率和固碳效率计算

微藻的油脂积累速率通过式（2）进行计算。

式中：PL为微藻油脂积累速率，mg/（L·h）；W0和Wf分别为每一培养周期开始与结束时的微藻生物量浓度，g/L；X0和Xf分别为每一培养周期开始与结束时的微藻油脂含量，mg/g；Δt 为培养时间，h。

微藻总碳含量采用Elementar 型总有机碳分析仪（TOC）测定，并通过式（3）计算微藻的固碳效率。

式中：Fc为微藻的固碳效率，mg/（L·h）；ω0和ωf分别为每一培养周期开始与结束时，微藻（干基）的碳含量，%。

2 结果与讨论

2.1 CO2 浓度对FACHB-9 生长和脂质积累的影响

当环境中的CO2浓度（体积浓度，下同）超过5%时，大多数微藻的生长会受到抑制，但有些小球藻在CO2浓度为5%~20%的条件下仍能生长良好[10]，[11]。 本文首先对FACHB-9 进行了CO2耐受性驯化，然后在普通环境下考察了CO2浓度对其生长和脂质积累的影响 （在本实验中，FACHB-9的初始接种浓度为0.310 g/L， 在培养箱光照结束前2 h 停止通入CO2气体），结果如图2 所示。

从图2（a）可以看出：FACHB-9 在给定的不同CO2浓度下均能生长良好；经过120 h 的培养，通入CO2的各组FACHB-9 的生物量浓度均远高于对照组（通入空气），其中，在CO2浓度为5%的条件下，FACHB-9 的生长速率最大， 最大生物量浓度为1.47 g/L。

从图2（b）可以看出：通入的CO2浓度越高，FACHB-9 的脂质含量越高； 通入空气培养120 h后，FACHB-9 的脂质含量为20.6%， 而通入浓度为20%的CO2培养120 h 后，FACHB-9 的脂质含量可达27.9%。 在利用燃煤电厂烟气中的CO2培养微藻时，不仅要关注微藻的生长速率，还要考虑微藻的油脂含量和烟气中的CO2浓度。 燃煤电厂排放的烟气中CO2的浓度为10%~15%， 因此，在以下研究中均采用浓度为10% 的CO2来培养FACHB-9， 且不考虑烟气中NOx，SO2等气体对FACHB-9 生长的影响。

图2 普通环境下，CO2 浓度对蛋白核小球藻生长和脂质含量的影响Fig.2 The effect of CO2 concentration on the growth and lipid content of Chlorella pyrenoidosa under general condition

2.2 FACHB-9 的生长情况

模拟的微重力条件和CO2对FACHB-9 生长的影响如图3 所示。

图3 蛋白核小球藻在不同培养条件下的生长曲线Fig.3 Growth curves of Chlorella pyrenoidosa cultivated in four different conditions

从图3 可以看出：培养120 h 后，在模拟的微重力条件下，SMGC 组的最大生物量浓度为1.54 g/L，比SMG 组高出70.6%；在普通条件下，GCC 组的最大生物量浓度为1.09 g/L， 比GC 组提高了92.9%，这一结果与文献[12]的研究结果相一致。 在通入的CO2浓度均为10%条件下，SMGC 组的最大生物量浓度比GCC 组提高了40.5%。 与GC 组相比，SMGC 组的最大生物量浓度提高了178%，这说明模拟的微重力条件与CO2对FACHB-9 的生长具有很好的协同促进作用。

增大CO2的浓度会导致藻液的pH 值降低，而酸性过大将影响微藻的生理机能进而抑制其生长。 为了消除无光照时高浓度CO2对微藻生长所产生的抑制作用，必须调控藻液的pH 值。 有研究表明， 在培养小球藻的过程中， 向藻液中添加NaOH 调控藻液的pH 值能够提高小球藻的生物量[13]。 但是，通过向藻液中添加碱来控制藻液的pH 值，碱的消耗或循环利用会导致培养工艺的复杂化且成本上升。 本研究通过调节光照和CO2的通气时间来调控藻液的pH 值。 在关闭光源前2 h停止通入CO2气体，使藻液中部分多余的CO2在2 h 内通过微藻的光合作用消耗掉，从而使得无光照时藻液的pH 值维持在一个适宜的范围内。 实验结果表明， 采用该方法调节藻液的pH 值时，FACHB-9 生长良好。

不同培养条件下， 藻液pH 值的变化曲线如图4 所示。

图4 藻液的pH 值在不同条件下的变化情况Fig.4 Changes of culture medium pH in different conditions

从图4 可以看出：在光照条件下，SMGC 组和GCC 组的藻液pH 值为5~6， 而SMG 组和GC 组的藻液pH 值为9~10； 当停止光照约5 h 后，4 种培养条件下的藻液pH 值均变为7.5 左右。在光照条件下，SMG 组的藻液pH 值低于GC 组，当停止通入CO2后，SMGC 组的藻液pH 值的上升速度明显比GCC 组快。这可能是因为在模拟的微重力条件下，微藻生长得更快，消耗得CO2更多。

2.3 FACHB-9 的油脂积累速率及脂肪酸组成

FACHB-9 在不同条件下培养120 h 后， 其油脂含量和油脂积累速率见表1。

表1 蛋白核小球藻在不同培养条件下的油脂含量与积累速率Table 1 Lipid content and accumulation rate of Chlorella pyrenoidosa under different cultivation conditions

由表1 可知：SMGC 组的油脂含量为23.2%，比相应的GCC 组稍低，但是SMGC 组的油脂积累速率是4 种培养条件中最高的； 与GC 组相比， GCC，SMG 和SMGC 组的油脂积累速率分别提高了361%，202%和536%。 以上结果表明，模拟的微重力条件以及高浓度的CO2气体对微藻的油脂积累速率有明显的促进作用。

不同培养条件下，FACHB-9 油脂的主要脂肪酸组成见表2。 由表2 可知：C14，C15，C16 和C18这4 种脂肪酸占FACHB-9 总脂肪酸含量的98%以上，在4 种不同培养条件下，C14 和C15 含量的差异不显著；SMGC 组和GCC 组的C18∶0 和C18∶2的含量显著低于SMG 组和GC 组， 而SMGC 组和GCC 组的C18∶3 含量显著高于SMG 组和GC 组。相较于普通条件， 在模拟的微重力条件下，FACHB-9 中不饱和脂肪酸（尤其是C18∶3）的含量显著下降。 如果将提取的油脂作为生产生物柴油的原料， 不饱和脂肪酸含量的下降会增加生物柴油的十六烷值， 这有利于提高生物柴油的氧化稳定性。

表2 不同培养条件下蛋白核小球藻油脂的主要脂肪酸组成Table 2 Main fatty acid compositions in Chlorella pyrenoidosa under different cultivation conditions

2.4 FACHB-9 的固碳效率

FACHB-9 在不同培养条件下的总碳含量及相应的固碳效率见表3。

表3 不同培养条件下蛋白核小球藻的碳含量及固碳效率Table 3 Carbon contents and carbon fixations efficiency of Chlorella pyrenoidosa under different cultivation conditions

由表3 可知， 在不同培养条件下，FACHB-9的固碳效率差异显著，SMGC 组的固碳效率最大，可达19.3 mg/（L·h）， 而GC 组的固碳效率仅为2.64 mg/（L·h）。 在不同CO2浓度下，FACHB-9 的生长速率、 脂肪酸含量和固碳效率等的变化规律和文献[11]的研究结论相一致。 与普通条件相比，在模拟的微重力条件下利用CO2培养FACHB-9时，由于微重力条件和CO2对微藻的生长具有协同促进作用，微藻的生长速率显著加快，因此，尽管微藻的脂肪酸含量及总碳含量变化不大， 但固碳效率显著提高。

2.5 FACHB-9 的细胞形态

为了更好地了解微重力条件和CO2对FACHB-9 生长的影响，采用SEM 对FACHB-9细胞进行了观察，结果见图5。 由图5 可以看出，FACHB-9 在不同培养条件下的细胞表面形态各不相同。GC 组的FACHB-9 细胞呈球形且表面光滑；GGC 组的FACHB-9 细胞较为扁平；SMGC 组和GCC 组的FACHB-9 细胞表面粗糙而且附着一些细小晶体，细胞表面附着的晶体可能是高浓度的CO2导致微藻细胞钙化形成的CaCO3晶体[14]。 微藻细胞的钙化可为其叶绿体获取CO2降低能量消耗，从而有利于光合作用。 在微重力条件下，FACHB-9 细胞发生变形，SMG 组的FACHB-9 细胞变形尤其明显，在细胞表面可以看到明显的褶皱，而微藻在太空中培养时细胞表面容易发生褶皱[15]。但SMGC 组的FACHB-9 细胞表面并没有发现明显的褶皱， 可能是因为通入高浓度的CO2后，FACHB-9 细胞的光合作用增强， 从而拥有更多的能量去维持细胞形态。

图5 蛋白核小球藻在不同培养条件下的细胞形态Fig.5 Cell morphology of Chlorella pyrenoidosa cultivated in different conditions

微重力条件和高浓度的CO2不仅改变了FACHB-9 细胞的形貌， 而且对藻细胞的大小也会产生影响。 在不同培养条件下，蛋白核小球藻细胞的直径分布如图6 所示。 从图6 可以看出：GCC 组与SMGC 组的FACHB-9 细胞直径为1.80~3.85 μm，GC 组和SMG 组的FACHB-9 细胞直径为1.21~3.20 μm。 GCC 组与SMGC 组的FACHB-9 细胞的平均直径分别为2.57 μm 和2.72 μm，二者均比GC 组和SMG 组的FACHB-9细胞直径大，可能是因为通入CO2后，FACHB-9细胞的钙化导致其体积增加。

图6 在不同培养条件下，蛋白核小球藻细胞的直径分布Fig.6 Distributions of diameter size of Chlorella pyrenoidosa cultivated in different conditions

3 结论

微重力条件和CO2对蛋白核小球藻的生长具有协同促进作用。 与普通环境下采用空气培养蛋白核小球藻相比， 微重力环境下通入浓度为10%的CO2培养蛋白核小球藻120 h 后， 蛋白核小球藻的生物量浓度提高了178%。 不同培养条件下，蛋白核小球藻的油脂含量变化不大，但生物量的大幅提高导致蛋白核小球藻的油脂积累速率和固碳效率显著升高。 同时，高浓度的CO2会导致蛋白核小球藻的不饱和脂肪酸含量上升， 而微重力条件则会使其不饱和脂肪酸含量下降。