上海市售肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌污染监测和定量分析

田明胜，王 颖，陈 波，厉曙光

(1.复旦大学 公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，上海 200032；2.上海市食品药品监督管理局执法总队，上海 200233)

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是一种广泛存在于农业和食品加工环境中的人畜共患病病原菌，可在低氧条件和冷藏温度下生长的特性使得其在环境、食品、加工厂内和家庭冰箱内长时间存活[1-2]。进食被单增李斯特菌污染食品可能导致的李斯特菌病是一种罕见但具有潜在致死性的疾病，主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，死亡率达20%～30%[3]。李斯特菌病的高死亡率，特别是暴发情况下单增李斯特菌常出现在规模化加工食品中[4]，使得李斯特菌病的社会及经济影响可能位居食源性疾病之首[5]。疾病监测数据显示：单增李斯特菌每年在美国大约引发2 500例发病，2 300例住院和500例死亡[6]；评估结果显示在美国熟肉制品造成李斯特菌病风险最大(1 600例/年)[7]。

2000—2009年我国文献报道了92例李斯特菌病例(32例发生在上海)[8]，2011—2016年又合计报告253例侵袭性李斯特菌病例[2]。我国目前尚缺乏单增李斯特菌病的流行病学负担报告，但即食肉制品污染单增李斯特菌的安全风险不容忽视[9]。上海市在2000年开始监测肉制品中单增李斯特菌的污染，如何定量确定肉制品中单增李斯特菌污染水平一直是各方探索的焦点[10-11]，本研究中，笔者对2008—2013年上海市售肉制品中单增李斯特菌污染监测数据进行分析，并采用蒙特卡罗抽样方法模拟计算单增李斯特菌污染水平，以便为开展定量风险评估奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

按月或季度采集各类市售肉制品，按无菌采样程序采样后冷链运输至实验室，按确定检测方法开展检验，6年合计抽样监测2 075件畜禽肉及其制品。

1.2 检测方法

根据文献[12]中第一法：常规培养方法对2008—2010年市售肉制品中单增李斯特菌污染进行定性检测。

参考国际标准组织ISO 11290-2:1998[13]和美国细菌学分析手册(BAM)中单增李斯特菌最可能污染数(MPN)检测程序[14]形成实验室标准操作程序(SOP)，对2011—2013年市售肉制品中单增李斯特菌污染进行定量检测。检测过程如下：无菌操作剪取25 g样品放于盛有225 mL缓冲蛋白胨水(BPW)的均质袋中，快速拍打1～2 min至样品完全混匀，用BPW进行10倍系列稀释，取10-1、10-2和10-3这3个稀释度样品匀液各1 mL，分别接种于10 mL缓冲李斯特菌增菌肉汤中，每个稀释度接种3管，合计9管。30 ℃培养48 h后，从变浊阳性培养管中取增菌液划线接种于李斯特菌显色平板，于37 ℃培养24 h后进行鉴定；对单增李斯特菌阳性检测结果查阅MPN表确定其污染值。

1.3 统计分析方法

定量检测结果采用“MPN/g”表示，定性检测结果采用“检出或未检出(以25 g计)”表示。按肉制品类别和采样时间分别进行汇总。采用IBM公司SPSS 20.0和Palisade公司@Risk7.5 for Excel软件进行统计分析和定量拟合。

2 结果

2.1 不同种类肉制品中单增李斯特菌污染率和污染值

笔者合计对2008—2010年的1 130件市售畜禽肉制品中单增李斯特菌污染进行了定性检测，结果见表1。由表1可知，在87件生鲜畜禽肉和1件散装即食肉制品中检出单增李斯特菌；对2011—2013年的945件市售畜禽肉制品中单增李斯特菌污染进行了定量检测，结果在2件散装即食肉制品和1件预包装即食肉制品中定量检出单增李斯特菌，3件阳性样品定量检测值分别为2.3、110和2.3 MPN/g。

表1 市售畜禽肉及其制品中单增李斯特菌污染情况

注：*指阳性数/总样品数。

2.2 肉制品中单增李斯特菌污染定量化

MPN法检测时预设食品中微生物污染符合泊松分布[15]，其污染值M可利用式(1)计算[16]。

M=-(2.303/V)lg(S/n)

(1)

式中：S为阴性样品件数；n为检测样品件数；V为检测取样量。

表2显示了假设单增李斯特菌污染符合泊松分布时各类肉制品中单增李斯特菌污染最可能值的计算结果。

表2 市售畜禽肉制品中单增李斯特菌污染情况(MPN/g)

注：*表示该类食品单增李斯特菌阴性，用纵向总体污染水平表示；**表示计算的阴性样品中单增李斯特菌可能污染值。

2.3 肉制品中单增李斯特菌污染定量模拟

泊松对数正态分布(Poisson Lognormal Distribution，PLN)有时可较好地模拟食物中微生物浓度[15,17]，假设各类肉制品中单增李斯特菌污染符合对数正态分布[18]，该分布均值可由样品中单增李斯特菌污染最可能值的对数均值计算获得，其标准差预设分布可假设为均匀分布[Uniform(0,4)]，即肉制品中单增李斯特菌污染符合正态分布：Normal[log(MPN/g)，Uniform(0,4)]，依据“拔靴法抽样原理”，可利用@Risk for Excel软件执行“蒙特卡罗抽样”模拟计算肉制品中单增李斯特菌污染水平[19]。鉴于生鲜畜禽肉、散装即食肉制品和预包装即食肉制品中单增李斯特菌污染率有显著差异(P<0.05)，使用@Risk7.5软件进行迭代抽样100 000次模拟计算三类产品中单增李斯特菌污染水平(图1～3)。

图1 市售生鲜畜禽肉制品中单增李斯特菌 污染水平(log(MPN/g))Fig.1 Contamination distribution of Listeriamonocytogenes in raw meat products (log(MPN/g))

图2 市售散装即食畜禽肉制品中单增李斯特菌 污染水平(log(MPN/g))Fig.2 Contamination distribution of Listeriamonocytogenes in bulk deli-meats (log(MPN/g))

图3 市售预包装即食畜禽肉制品中单增李斯特菌 污染水平(log(MPN/g))Fig.3 Contamination distribution of Listeriamonocytogenes in prepackaged RTE meats (log(MPN/g))

2.4 各类肉制品中单增李斯特菌污染水平

定量模拟结果显示市售生鲜畜禽肉制品、散装即食肉制品和预包装即食肉制品中单增李斯特菌污染符合泊松对数正态分布(-2.419，2.336)、(-3.735，2.325)和(-3.870，2.334)(log(MPN/g))。根据对数正态分布理论可计算样品中单增李斯特菌污染达到3.0 MPN/g或0.3 MPN/g的概率(表3)，由表3可发现在市售畜禽肉制品的单增李斯特菌污染监测中，增加检测接种量可获得更多阳性结果，增加取样件数也可获得更多阳性结果，据此改进监测方案可更好地评估市售畜禽肉制品中单增李斯特菌污染水平。

表3 上海市售肉制品中单增李斯特菌污染水平 (log(MPN/g))

注：*P1表示污染水平>3.0 MPN/g的概率；**P2表示污染水平>0.3 MPN/g的概率。

3 讨论

通过抽样监测获得病原微生物在食品中污染率和污染水平是开展食品微生物定量风险评估的基础。国内对致病微生物监测结果分析主要集中于报告检出率(阳性率)[20-21]或者对阳性检测值计算其几何均数和标准差[22-23]，对于低于检出限样品中微生物污染水平的研究较少[24-25]。

2008—2013年上海市市售肉制品中单增李斯特菌污染结果显示生鲜畜禽肉(11.28%)，散装即食肉制品(0.35%)和预包装即食肉制品(0.22%)中单增李斯特菌污染率与江苏省[20]、广东省[21]和北京市[22]等省市监测结果一致。

结合“微生物污染分布理论”和“拔靴法抽样原理”，笔者利用随机抽样软件探索给出了确定食品中病原微生物污染水平的简单方法，该方法对“定性检测(2008—2010年)、定量检测(2011—2013年)和部分定量检测(2008—2013年)结果”均可在分析阳性检测结果比例基础上计算食品中微生物最可能污染值(MPN)，并借助软件“可视化”的模拟评估微生物在相应食品中的污染水平。定量模拟结果显示市售“散装即食畜禽肉制品”和“预包装即食畜禽肉制品”中单增李斯特菌污染水平低于“生鲜畜禽肉”，有101.316=20倍差异，此差异能基本反映上海市肉制品加工销售中单增李斯特菌污染控制水平。

根据对数正态分布理论可计算各类肉制品中单增李斯特菌污染>3.0 MPN/g或>0.3 MPN/g的概率(表3)，鉴于即食熟肉制品污染单增李斯特菌导致消费者罹患李斯特菌病的风险最高[5]，依据研究中单增李斯特菌模拟计算污染水平与检测限的比较，建议在实际监测工作中增加接种量，当然增加抽样件数也可获得更多阳性监测结果，从而为定量风险评估奠定基础[26]。

4 结论

研究表明上海市售即食肉制品中单增李斯特菌污染较严重。利用随机抽样软件比较准确地模拟了计算肉制品中单增李斯特菌污染水平，计算的定量污染水平可用于改进肉制品单增李斯特菌污染监测方案，并可为肉制品单增李斯特菌污染定量风险评估的开展奠定基础。