外加电压对污泥厌氧消化产甲烷同步降解菲的影响

林超霸，李 莲，祝佩茹，费吉东，谢欣欣，贾红华， 雍晓雨，吴夏芫，周 俊

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800； 2.南京工业大学 生物能源所，江苏 南京 211800；3.南京工业大学 环境学院，江苏 南京 211800)

随着城市化和工业化的进一步加快，污水的排放量和处理量逐年增加，市政污泥是城市污水处理厂处理生活污水的必然产物，其处置问题引起科研工作者的关注[1-2]。一方面，污泥中含有大量的有机物，将污泥作为一种廉价能源是一种有效的处置选择；另一方面，污泥中携带重金属、病原体及其他难降解有机污染物，处置不当将对环境形成巨大的威胁[3-4]。

污泥厌氧消化是实现污泥的稳定化、减量化、无害化和资源化的有效手段[5-6]。它是在厌氧条件下通过产甲烷菌将有机质转化为生物能源的技术，但是污泥中高浓度的有机污染物对产甲烷菌有明显毒害作用，这成为限制污泥厌氧消化速率的主要因素之一[7]。其中，多环芳烃(PAHs)是污泥中的一种典型有机污染物，大多数多环芳烃具有致癌性、致畸性和致突变型，在水中的溶解度低，导致其生物可利用度低，难以降解。Trably等[8]发现PAHs的去除效率与产甲烷性能密切相关，产甲烷性能成为PAHs降解菌活性的重要指标。

微生物电解池(MEC)，是一种集污染物处理与能量回收为一体的新型技术，已经被广泛应用于工业废水的处理中。王晓洁等[9]利用单室MEC在外加电压为1.0 V条件下降解废水，废水中的化学需氧量(COD)降解率达到72.37%，H2累计产量为156.10 mL，证明了优化外加电压条件提高产氢性能及降解有机物的可行性。Daghio等[10]利用施加不同电压在单室MEC中去除苯、甲苯、乙苯和二甲苯(BTEX混合物)，当外加电压为0.8 V时，观察到最高电流密度(200 mA/m2),并且能增加BTEX混合物的去除速率，甲苯、间二甲苯和对二甲苯的去除率常数分别达到(0.4 ± 0.1)、(0.34 ± 0.09)和(0.16 ± 0.02) /d。同时MEC可促进甲烷产生及提高沼气中的甲烷浓度，薄涛等[11]利用不锈钢毡电极MEC处理含乙酸的废水，在外加电压为1.0 V条件下，甲烷体积分数达到(96.96±1.19)%,甲烷产生速率达到(1.18±0.04)L/(d·L)，乙酸的去除率达到(100±0.05)%。Chen等[12]采用不同电压(0.3～1.5) V电刺激促进污泥厌氧消化，在外加电压为0.6 V时，与对照组相比，甲烷产量增加了76.2%，挥发性固体(VS)的去除率提高了26.6%。Zhang等[13]利用MEC对100 mmol萘进行生物修复，9 d后，萘被完全去除，证明了电极可充当电子受体促进芳烃的降解。然而在污泥厌氧消化中实现污染物的去除同步产甲烷却鲜有报道。

因此，本文中，笔者旨在探讨不同外加电压对污泥厌氧消化产甲烷同步降解菲的影响，并通过微生物多样性分析外加电压对发酵液及电极表面的细菌和古菌群落结构的影响，发掘外加电压对污泥厌氧消化产甲烷同步降解菲的微生物学影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

供试污泥来源于南京市某污水处理厂二沉池浓缩市政污泥，取回后的原始污泥放置于4 ℃冰箱待用。原始污泥的基本性质见表1。

表1 原始污泥和接种污泥的基本性质

南京工业大学生物能源研究所沼气站沼液接种在添加菲的原始污泥体系中，驯化一个月，待甲烷产量稳定后，作为接种污泥备用。接种污泥中微生物活性较高，并驯化出耐受菲的微生物，以缩短产甲烷的启动时间。接种污泥的基本性质见表1。

1.2 方法

采用1 L的厌氧消化瓶为反应器，顶部橡皮塞上插有电极，以碳毡作为阳极，碳纸作为阴极，分别由直流稳压电源为该消化体系提供0、0.4、0.8、1.2和2.5 V的电压，以外加电压为0 作为对照组。消化污泥(1 L)由70%原始污泥及30%接种污泥构成，体系中按照50 mg/L的浓度添加菲，菲先溶于丙酮溶液，然后添加到反应器中摇晃均匀。向反应器中通N2排除消化瓶中的O2，保证反应器中的厌氧环境，将反应器放置于(38±1) ℃恒温培养箱中进行厌氧消化。实验采用排水集气法计算单日沼气产量，定期取污泥样品进行各指标的检测，所有实验组均设置3组平行。

甲烷产率为甲烷总产量与原始泥固体含量的比值，具体计算见式(1)。

(1)

式中：y为甲烷产率，L/kg;24表示整个消化周期的时间，d；xi为第i天沼气产量，mL；φi为第i天甲烷体积分数，%；TS0为原始泥固体含量，kg。

1.3 检测方法

pH使用UB-7型pH测定仪测定；TS、VS均采用质量法测定；SCOD采用重铬酸钾法测定；氨氮采用纳氏比色法测定；总有机碳(TOC)采用TOC-LCPN型有机碳测定仪测定。甲烷含量采用SP6800A型气相色谱仪，热导检测器，分析条件参照文献[14]进行，具体为采用HP-PLOTU毛细管柱和HayeSep Qporous聚合物色谱，柱温为120 ℃，载气为N2，流速为50 mL/min。有机酸采用Agilent 6890A型气相色谱仪测定，气相色谱分析条件参照文献[15]进行，具体为初始柱温为100 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min的速率升至250 ℃并保持12 min。

1.4 菲的萃取及检测

1)固相样品的萃取。准确称取0.5 g冷冻干燥后的样品(与等量无水Na2SO4混合均匀)。用20 mL正己烷与二氯甲烷 (V∶V=1∶ 1) 超声萃取60 min，重复3次，合并萃取液。将萃取液全部倒入硅胶柱(依次为1 g无水Na2SO4，2 g硅胶，1 g无水Na2SO4)净化，将萃取液旋转蒸发至近干后，加入4 mL甲醇定容，超声30 s后过0.22 μm有机膜。

2)液相样品的萃取。取离心(7 500 r/min、10 min)后上清液10 mL于玻璃离心管中，用10 mL二氯甲烷超声萃取30 min后静置10 min，重复3次，合并萃取液。将萃取液旋转蒸发至近干后，加入4 mL甲醇定容，超声30 s后过0.22 μm有机膜。

3)菲的检测方法。将过膜后的样品通过Agilent1200型高效液相色谱检测，色谱柱为4.6 mm×250 mm的C18柱，检测条件：流动相为甲醇，流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为254 nm，进样量为10 μL；检测时长为10 min。

1.5 菲降解的一级动力学模型

使用一级降解速率模型式(2)估算菲降解动力学。

ρt=ρ0e-kt

(2)

式中：ρt为时间t时厌氧消化过程中菲的质量浓度，mg/L；ρ0为初始菲的质量浓度，mg/L；t为消化周期，d。

1.6 DNA提取与微生物多样性分析

在污泥厌氧消化过程稳定期，取各个组的污泥样品离心(7 500 r/min、15 min)，使用 Power Soil DNA提取试剂盒(MOBIO Laboratories)从污泥样品中提取DNA。将DNA样品进行PCR扩增与纯化，PCR引物为515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′)和909R(5′CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)。使用以下程序进行PCR反应：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，28个循环；72 ℃ 5 min，然后将样品交由上海美吉生物医药有限公司进行凝胶电泳及高通量测序，最后通过美吉i-sanger平台进行物种多样性指数分析和群落结构的统计分析。

2 结果与讨论

2.1 外加电压对污泥厌氧消化产气的影响

考察不同外加电压对污泥厌氧消化的单日沼气、单日甲烷及其产率的影响，结果见图1。由图1可知：单日沼气产量整体呈现先上升后下降的趋势，所有实验组均在 14 d左右到达产气高峰。其中，单日沼气产量最高值为外加电压为2.5 V实验组的945 mL。

图1 外加电压对污泥厌氧消化过程中单日沼气产量、单日甲烷产量及其产率的影响Fig.1 Effects of applied voltages on production of single-day biogas and methane,yield of biogas and methane in sludge anaerobic digestion

当外加电压为0.4、0.8、1.2 和2.5 V时,甲烷产率分别为107.66、136.36、129.26和115.51 L/kg(以1 kg总固体计)。与0 V对照组(102.1 L/kg)相比，甲烷产率分别提高了5.45%、33.56%、26.6%和13.13%，说明外加电压能够显著提高污泥厌氧消化的产气效率，其中外加电压为0.8 V甲烷产率最高，与Choi等[16]的结果相似。这是因为外加电压一方面能催化体系中的氧化还原反应，促进难分解有机质的水解，使厌氧微生物可利用有机质含量增加，提高甲烷产率；另一方面，碳基电极可充当产甲烷菌的电子供体，加快厌氧消化体系中电子传递速率，为厌氧消化产甲烷提速[17]。

厌氧消化的目的是利用污泥中有机质生产甲烷，使污泥中的固体含量减少，从而实现污泥的减量化。图2所示为污泥厌氧消化前后各实验组总固体TS及挥发性固体VS的含量及其去除率。

图2 外加电压对污泥厌氧消化过程中TS、VS的影响Fig.2 Effects of applied voltages on TS and VS during sludge anaerobic digestion process

由图2可知，外加电压实验组中TS、VS去除率均明显高于对照组。其中外加电压为0.8 V时，TS去除率为18.1%，VS去除率为43.88%，均高于其他实验组。这表明外加电压提高厌氧消化体系中有机质的去除率，进而提高甲烷产量；而0.8 V外加电压实验组展现出了最佳的TS去除率及甲烷产率。

图3 外加电压对污泥厌氧消化过程中 TOC和SCOD的影响Fig.3 Effects of applied voltages on TOC and SCOD during sludge anaerobic digestion process

2.2 外加电压对污泥厌氧消化体系中TOC、SCOD、pH、N-的影响

TOC与SCOD均是反映消化液中有机物含量的参数。图3显示了厌氧消化过程中的TOC和 SCOD含量变化。由图3可知，各个实验组的整体趋势相近，在消化前期，TOC和SCOD含量都有略微上升，这是由于有机质的水解速率比产甲烷菌消耗的速率快，随后，可溶性有机物的完全水解和大量微生物的消耗逐渐降低TOC与SCOD含量，并最终保持水解与消耗之间的动态平衡以维持TOC与SCOD含量稳定。对比各实验组消化过程中TOC与SCOD的最高值可以发现，外加电压能促进难降解有机质的水解[18]；对比稳定后的TOC与SCOD含量，其去除率在外加电压实验组中高于对照组。

pH随消化时间的变化情况如图4所示。由图4可知，初始pH为6.83，在厌氧消化前期，由于有机质的水解，酸化导致厌氧消化体系的pH呈下降趋势，在产气高峰期，各实验组的pH均达到最低值。随后，产甲烷菌大量消化短链脂肪酸产生甲烷，pH逐渐上升。整个消化周期中pH均为6.4～7.5，表明整个消化周期比较稳定，未出现明显的酸化或者pH过高进而抑制产甲烷菌活性的现象。Ye等[19]研究发现，即使在极端环境下仍发现有产甲烷菌，但是大多数产甲烷菌在中性环境下活性更高。

图4 外加电压下污泥厌氧消化过程中pH的变化Fig.4 Effects of applied voltages on pH during sludge anaerobic digestion process

氨氮浓度是厌氧消化过程中的重要指标，其主要由含氮物质(蛋白质、氨基酸等)在微生物作用下分解产生，而氨氮浓度过高会抑制厌氧消化中微生物的活性，尤其是产甲烷菌[20]。由于不同产甲烷菌对氨氮的耐受程度不同，高氨氮体系易影响消化过程中优势产甲烷菌属的相对丰度[21]。图5为不同外加电压下污泥厌氧消化过程中氨氮的变化。由图5可知，各实验组氨氮浓度均呈现先下降后上升并逐渐趋于稳定的变化趋势，各实验组最终氨氮均在3 000 mg/L 左右，这表明在合理的范围内，污泥厌氧的消化过程中均未出现严重的氨抑制的现象。

图5 外加电压对污泥厌氧消化过程中氨氮的影响Fig.5 Effects of applied voltages on during sludge anaerobic digestion process

2.3 不同外加电压的污泥厌氧消化体系中有机酸积累量的变化

图6为不同外加电压的污泥厌氧消化体系中有机酸主要组成累积量随时间的变化曲线。有机酸的主要成分为乙酸、丙酸和丁酸。

图6 外加电压对污泥厌氧消化过程中乙酸、 丙酸和丁酸浓度的影响Fig.6 Effects of applied voltages on acetic acid,propionic acid and butyric acid during sludge anaerobic digestion process

由图6可知：与对照组相比，外加电压大幅增加水解酸化阶段乙酸的积累量；而在消化末期，对照组乙酸、丙酸及丁酸残留量显著高于其他实验组，这表明，外加电压实验组对有机酸的消耗速率及对有机酸的利用效率远高于对照组。外加电压实验组生物电化学系统中微生物和电化学的相互作用会增强体系的反应，因此外加电压能够影响微生物的活性，进而影响其对有机物的降解效果。由此可知外加电压促进了微生物的活性，从而使有机酸的消耗速率更快。

2.4 不同外加电压对污泥厌氧消化降解菲的影响

图7所示为不同外加电压下污泥厌氧消化过程中菲的降解率。

图7 外加电压对污泥厌氧消化过程中菲的降解率影响Fig.7 Effects of applied voltages on phenanthrene removal rate during sludge anaerobic digestion process

由图7可知，在24 d的厌氧消化过程中，对照组中菲的质量浓度由50 mg/L降至35.83 mg/L，降解率为28.34%。然而外加电压为0.4、0.8、1.2 及2.5 V 实验组菲降解率分别为32.34%、43.88%、36.9%以及36.68%。这表明外加电压能促进菲的降解，提高污泥厌氧消化过程中菲的降解率。

菲降解动力学常数及半衰期结果如表2 所示。各实验组中与t之间的线性关系良好，表明污泥厌氧消化中菲的降解都符合一级反应动力学。在对照组中菲降解的半衰期为45.6 d，而外加电压为0.4、0.8、1.2及2.5 V实验组中，菲降解的半衰期分别减少为39.4、25.6、32.4及37.3 d。这表明，一方面外加电压能促进有机物的水解，增大菲在水相中的分配系数，进而提高其生物可利用度[22]；另一方面，外加电压可为厌氧消化体系提供还原力，催化氧化还原反应，促进菲的降解[23]。

表2 菲降解动力学常数、相关系数及半衰期

Table 2 Reaction rate constant,correlation coefficient and half-life of phenanthrene during phenanth-rene degradation

电压/V动力学常数k相关系数(R2)半衰期/d00.015 20.976 545.60.40.017 60.978 439.40.80.027 10.961 625.61.20.021 40.965 432.42.50.018 60.977 937.3

2.5 外加电压对污泥厌氧消化体系中污泥样本的微生物多样性的影响

表3为不同外加电压下污泥厌氧消化体系中微生物菌群的Alpha 多样性指数分析结果。

由表3可知，各实验组中Coverage指数均在0.99左右，表明测序结果可以反映厌氧消化系统中微生物群落的真实情况。当外加电压越高，微生物的OUT数越少，Chao1指数与Ace指数越小，表明微生物群落中物种总数随着外加电压增高而减少。

表3 外加电压对污泥厌氧消化体系中污泥样本的微生物多样性指数的影响

注：OUT—结构分类单元；Ace、Chao 1—估计群落中物种总数的一种指数；Coverage—评估测序相对于整体样本的覆盖程度；Shannon、Simpson—评估样品中微生物多样性的指数。

Shannon 指数逐渐减小，Simpson指数逐渐增大，表明微生物群落多样性随着外加电压的增高而减少，高电压对功能微生物具有高度选择性。

对各实验组的污泥样品所测到的OTUs分别进行门、科以及属水平上的分析，结果见图8。

由图8可知：在不同外加电压下，污泥厌氧消化过程中污泥样本的微生物群落在门水平上的相对丰度，其中Bacteroidetes、Proteobacteria和Chloroflexi为原始泥中的优势菌门，其相对丰度分别为29.61%、38.74%和9.51%。Chen等[12]研究发现，Bacteroidetes在厌氧消化后，各实验组中Proteobacteria和Chloroflexi的相对丰度有显著降低，同时Cloacimonetes、Spirochaetae和Firmicutes等菌门的相对丰度有明显的提高，并已然成为优势菌门。这些细菌大多数参与厌氧消化的水解与酸化，其中，Firmicutes和Proteobacteria被报道与BES中产生电流有关[24]。除此之外，Chloroflexi和Bacteroidetes被报道具有去除复杂碳化合物的能力[25-26]。各实验组之间优势菌门差异不明显，但有趣的是，当外加电压为0.4 V时，Euryarchaeota的相对丰度达到10.45%，明显高于其他实验组。所有的产甲烷菌均属于Euryarchaeota[27]，表明低电压能促进产甲烷菌的生长，但是过高的电压可能会抑制产甲烷菌的富集。进一步验证了高电压对微生物的高度选择性，并且体系中微生物多样性会减少。

在纲水平上，Bacteroidia、Spirochaete和Clostridia以及各类变形菌为优势菌纲，大多参与有机物的水解。其中，Park等[28]报道Bacteroidia能水解蛋白质并将产生的氨基酸转化为乙酸盐，Clostridia直接分解有机物转化为乙酸盐。同时Xafenias等[29]证明了Clostridia能提高COD的去除率，它可能是菲降解的主要参与者。

图8 外加电压对污泥厌氧消化过程中微生物群落在门水平、纲水平及属水平上相对丰度的影响Fig.8 Effects of applied voltages on relative abundance of phylum,class and genus at bacterial level in anaerobic digestion of sludge

在属水平上，Blvii28、norank-PBS-18和norank-Spirochaetaceae为优势菌属，大多是污泥中常见的菌群。除此之外，Pseudomonas是污泥厌氧消化中新增的菌属，未在原始泥中被发现。Pseudomonas是厌氧环境中最常见的能降解PAHs的菌属之一，Liang等[30]发现，Pseudomonas能降解Bap、荧蒽和菲；李想等[31]发现，Pseudomonassp.LX2能高效降解芘。最后未分类的Comamonadaceae同样在污泥中被发现，它有能编码降解PAHs的双加氧酶基因，是菲降解的主要微生物[32-33]。

2.6 外加电压对污泥厌氧消化体系中电极上微生物群落的影响

为了进一步探究外加电压对污泥厌氧消化体系中产甲烷形式的影响，从古菌属水平上分析了电极生物膜上微生物群落的丰度，即使阳极生物膜与阴极生物膜共享单个细胞菌群。但是由于它们不同的电势，对微生物的吸附具有选择性，也就是说，两电极间存在明显的群落结构差异。图9为不同外加电压下污泥厌氧消化过程中电极上微生物群落在古菌属水平上的相对丰度。

图9 外加电压对污泥厌氧消化过程中电极上微生物群落在古菌属水平上相对丰度的影响Fig.9 Effects of applied voltages on relative abundance of genus on the electrodes at the archaeal level in anaerobic digestion of sludge

由图9可知，Methanoseata是阳极生物膜上的主要产甲烷菌，但是随着外加电压的增加，Methanolinea和Methanobacterium的相对丰度也有增加。在阴极生物膜上，Methanosaeta与Methanospirillum在0、0.4 V实验组中占绝对优势，两者相对丰度之和分别达到82.83%和88.6%。但是在0.8、1.2以及2.5 V实验组中，Methanobacterium成为阴极生物膜上的优势产甲烷菌，它属于氢型产甲烷菌属[34]。由此可知，阴极表面发生还原反应，是甲烷产生的主要场所。

3 结论

1)外加电压能极大促进污泥厌氧消化产甲烷，0.8 V外加电压实验组甲烷产率达到136.36 L/kg TS，比对照组提高33.56%；同时对污泥中污染物菲的去除率达到43.88%。

2)外加电压的大小对厌氧消化体系中微生物群落结构有较大的影响，当外加电压低于0.8 V时，该体系优势产甲烷菌为乙酸型产甲烷菌属；当外加电压高于0.8 V时，该体系优势产甲烷菌为氢型产甲烷菌属。