新疆沙枣叶提取物对春尺蠖多酚氧化酶的抑制作用

徐 彤，郑旭东，崔羽歆，王 俊，朱慧玲，付建红，姚雪丹

(新疆师范大学 生命科学学院 新疆特殊环境物种多样性应用与调控重点实验室新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054)

昆虫在其一生中要经历几次蜕皮，初生的新表皮柔软色淡，经过硬化和黑化过程变坚硬。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PO)是这一黑化硬化过程中的关键性酶，它能够催化单酚羟化为二酚(如L-DOPA)，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下最终生成黑色素[1]。多酚氧化酶不仅参与黑色素形成、角质硬化和伤口愈合，还作为非自身识别系统在对寄生物的防御反应中发挥作用。由于不同昆虫体内的多酚氧化酶表现不同的酶学特性，因此深入研究不同来源多酚氧化酶的生物学特性，对开发新型“环境友好”杀虫剂具有重要的理论及现实意义[1]。

春尺蠖(ApochemiacinerariusErsch)又称杨尺蠖，属鳞翅目尺蛾科，该害虫食性杂、适应性强，除危害果树外，对新疆塔里木河中下游濒危植物胡杨亦构成较为严重的危害[2]。采用化学方法防治，存在害虫抗药性增强及环境污染等问题[3]。筛选对PO具有强力抑制作用的化合物是开发以PO为靶标的新型农药的有效途径。许多化合物对昆虫PO具有较好的抑制作用，如槲皮素、曲酸、苯甲醛类、苯甲酸类及苯甲醛缩氨基硫脲类等化合物及其类似物[4-10]，而鳞翅目尺蛾科害虫的PO抑制剂的研究仅有零星报道，张永亮等[1]研究了槲皮素、硫脲对桑尺蠖PO具有抑制作用，刘春英等[11-12]研究了槐尺蠖PO和枣尺蠖PO的酶学性质并发现槲皮苷和硫脲对酶活性有抑制作用。

尖果沙枣(ElaeagnusoxycarpaSchlechtend)属胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagnus)，其花、果、枝、叶和树皮都可入药，能治疗慢性支气管炎、闭合性骨折、消化不良、神经衰弱等病症[13]。目前，国内外学者对沙枣花、果的化学成分进行了研究，而对沙枣叶的化学成分及其生物活性的研究报道较少。夏米斯巴奴·艾则孜等[14]通过化学成分预试验初步判定新疆沙枣叶中含有多肽、蛋白质、有机酸、酚类、鞣质、皂苷、黄酮、甾体和三萜类等成分。王培香等[15]通过DPPH法测定了沙枣叶醇提取物各组分的抗氧化活性。Pumnuan等[16]研究发现沙枣叶醇提取物对小菜蛾幼虫的杀虫特性，但杀虫机制尚不明确。

本文中，笔者采用中压色谱和C18反相制备型色谱技术从新疆尖果沙枣叶中分离得到6个化合物，并测定了其中2个化合物对春尺蠖多酚氧化酶的抑制作用，旨在发现新型酚氧化酶抑制剂，为综合开发利用新疆沙枣树植物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

春尺蠖5龄幼虫采自新疆乌鲁木齐近郊某农场农田防护林榆树上，将其置于-20 ℃下保存备用。尖果沙枣叶采于新疆吐鲁番地区。植物叶洗净、阴凉处晾干后粉碎备用。

1.2 方法

1.2.1 多酚氧化酶的制备

参照文献[11]的方法并略有改进。取冰冻保存的春尺蠖幼虫按1 g∶ 10 mL的比例加入预冷的pH 6.5、0.02 mol/L磷酸缓冲液(PBS)冰浴匀浆，4 ℃下抽提30 min，6 000 r/min离心30 min。向上清液中加入40%饱和度的硫酸铵，4 ℃静置30 min后，6 000 r/min离心30 min。收集沉淀，用适量PBS使其充分溶解，并在相同的缓冲液中透析24 h，其间更换3～4次缓冲液，浓缩后经Sephadex G-100凝胶过滤，即得到待测的春尺蠖多酚氧化酶酶液。

1.2.2 多酚氧化酶的活力测定

参照文献[17]的方法并略有改进。向1.5 mL 14 mmoL/L邻苯二酚溶液中加入1.4 mL 0.02 mol/L pH 6.5的PBS，30 ℃水浴中温育30 min后，加入0.1 mL酶液混匀，于410 nm下测定吸光度A410随时间变化的曲线，从直线的斜率可求得该酶活力，以每分钟每毫克蛋白吸光度改变0.001定义为1个酶活力单位(U)。

1.2.3 酶的最适pH测定

设定酶反应体系缓冲液的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0。其中，pH 3.0、4.0和5.0用0.01 mol/L HAc-NaAc缓冲液，pH 9.0和10.0用0.01 mol/LGly-NaOH缓冲液，其余用0.01 mol/L PBS。以邻苯二酚为底物，测定pH对酶活力的影响。

1.2.4 酶的最适温度测定

将酶反应体系分别置于不同温度(10、15、20、25、30、35和40 ℃)水浴中保温30 min。然后加入酶液，立即测定残留酶活力。以A410最高时的酶活力作为100%，以相对酶活力与温度作图。

1.2.5 酶的热稳定性测定

将酶液分别置于30、35、40、45、50、55、60和70 ℃的恒温水浴中保温15 min，每5 min取出一次酶液，测定酶的残留酶活力。

1.2.6 底物专一性及米氏常数(Km)测定

以不同浓度的邻苯二酚(3.33～20 mmol/L)、L-多巴(0.4～2 mmol/L)和焦性没食子酸(0.43～5 mol/L)为底物，按照酶活力测定方法分别在各自最适波长下测定酚氧化酶对不同底物的米氏常数(Km)，比较底物专一性。

1.2.7 沙枣叶化学成分的提取与分离

粉碎的尖果沙枣叶中加入体积分数为60%的乙醇溶液浸提，超声提取后抽滤，离心后上清液减压蒸馏。得到的乙醇提取物中加入等体积的乙酸乙酯，分3次萃取得到的乙酸乙酯相萃取液减压蒸馏浓缩，用含2%二甲基亚砜的pH 6.8、0.1 mol/L PBS溶解得到的沙枣叶醇提取物。采用甲醇水梯度洗脱的方式先进行划段，共收集到61个组分，根据色谱分析结果将61个组分中主要成分相同的进行合并得到25个组分(Fr)。根据体外酶活性测定结果合并重复的化学成分，有11个组分具有较明显的主峰，进一步采用C18反相硅胶柱精制分离得到单体化合物。采用核磁共振、质谱等方法对分离的化合物进行表征。

1.2.8 沙枣叶单体化合物对多酚氧化酶活力的影响

在以邻苯二酚为底物的测活体系中，加入不同浓度的单体化合物，以不加化合物为对照，测定酶相对的剩余活力，比较导致酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC50值)，根据IC50值阐明其抑制强度。

2 结果与讨论

2.1 多酚氧化酶的制备

为了研究不同饱和度的硫酸铵溶液制备多酚氧化酶的效果，对多酚氧化酶粗提液进行分级盐析，取各饱和度下的上清液和沉淀分别测定并比较酶活力，结果见表1。由表1可知：用40%饱和度硫酸铵处理过后的沉淀中酶相对活力最高，此时酶比酶活提高2.66倍，回收率为68.6%，表明用饱和硫酸铵溶液对春尺蠖酚氧化酶进行纯化可取得较好效果。然而，经Sephadex G-100柱层析纯化后，活力回收率较低，仅为9.01%，纯化倍数为6.06倍。此结果表明用Sephadex G-100进行柱层析对该酶的纯化效果不太理想。

表1 春尺蠖多酚氧化酶的部分纯化

2.2 多酚氧化酶的酶学特性

2.2.1 pH对酶活力的影响

在pH为5.0～7.5的范围内测定不同pH对春尺蠖多酚氧化酶活性的影响，结果见图1。

由图1可知：当磷酸缓冲液的pH为6.5时，PO酶活力达到最大值，pH为6.0和7.0时，活性分别为最大值的65.4%和55.9%；当缓冲液pH为5.0时，活性下降约55%，当pH为7.5时，活性降至最大活性的32.1%。

图1 pH对春尺蠖多酚氧化酶活力的影响Fig.1 Effect of pH on polyphenol oxidase activity from Apochemia cinerarius Ersch

图2 温度对春尺蠖多酚氧化酶活力的影响Fig.2 Effect of temperature on polyphenol oxidase activity from Apochemia cinerarius Ersch

图3 温度对春尺蠖多酚氧化酶稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on polyphenol oxidase stability from Apochemia cinerarius Ersch

2.2.2 温度对酚氧化酶活力的影响

春尺蠖多酚氧化酶活力与温度的关系如图2～图3所示。

由图2可知：当温度在 10～25 ℃之间时，酶活力随着温度的升高而增加；温度高于25 ℃时，酶活力则随着温度的升高而下降。因此，以邻苯二酚为底物，酚氧化酶的最适温度为25 ℃。

由图3可知，在每个设定的实验温度下，随着保温时间的延长，酶活力均呈下降趋势。如在45 ℃下保温5 min后，酶活力仅为原活力的50.8%；特别当温度升至50 ℃以上时，随着保温时间的延长，酶活力下降较为迅速；至60 ℃时保温15 min，酶趋于失活。由此可知，春尺蠖多酚氧化酶是一种热稳定性较低的酶。酶对温度的敏感性，首先与酶分子本身的结构有关，其次与一系列条件(如酶的纯度、浓度、有无底物和保护剂存在、介质的pH离子强度等)有关。

2.2.3 多酚氧化酶底物专一性及米氏常数(Km)测定

在最适pH和最适温度条件下，分别改变底物邻苯二酚、L-多巴或焦性没食子酸的浓度，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，求得春尺蠖酚氧化酶催化邻苯二酚、L-多巴和焦性没食子酸的Km值分别为1.11、1.3和6.45 mmol/L。由此可知，春尺蠖酚氧化酶与底物L-多巴的亲和力略小于与底物邻苯二酚的亲和力，两者均大于该酶对底物焦性没食子酸的亲和力。

2.3 沙枣叶化学成分的分离

对尖果沙枣叶用体积分数60%乙醇提取，并对提取物的化学成分进行初步研究，用常压色谱、中压制备色谱和C18反相制备型色谱等方法进行分离纯化，从中分离6个化合物，目前已鉴定了2个化合物，其余单体化合物正在进行鉴定。化合物6的结构经与文献[18]比较，与L-色氨酸相似，故鉴定为L-色氨酸，其化学结构式及图谱如图4所示。化合物7的结构经Scifinder检索为首次从该植物中分离得到的一种新化合物，命名为“沙枣叶苷”，其化学结构式及图谱如图5所示。

图4 化合物6的结构式、1H NMR和13C NMR谱图Fig.4 Structural formula,1H NMR and 13C NMR spectra of compound 6

图5 化合物7的结构式、1H NMR和13C NMR谱图Fig.5 Structural formula,1H NMR and 13C NMR spectra of compound 7

2.4 沙枣叶单体化合物对多酚氧化酶活力的影响

分别以化合物6和化合物7为效应物，研究它们对春尺蠖多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化反应活力的影响，结果见图6。

由图6可知：这2种单体化合物对多酚氧化酶活力均有较大的影响，酶的剩余活力与效应物的浓度呈依赖关系，随着抑制剂浓度的增大，酶活力逐渐下降。两种化合物的质量浓度低于0.125 mg/mL时，多酚氧化酶的活力下降较快；随着浓度的增大，酶活力下降趋于平缓。经0.125 mg/mL的化合物6作用后，多酚氧化酶的剩余酶活力为46.9%，经0.125 mg/mL化合物7作用后，酶的剩余酶活力为50.9%。由图6可知，2种化合物对春尺蠖多酚氧化酶活力的IC50值约为0.125 mg/mL。

图6 沙枣叶中分离的两个化合物对春尺蠖多酚 氧化酶活力的影响Fig.6 Effects of two compounds isolated from leaves of Elaeagnus oxycarpa Schlechtend on phenoloxidase activity

3 结论

采用40%饱和度的硫酸铵沉淀和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤对新疆乌鲁木齐春尺蠖多酚氧化酶进行纯化，使比酶活提高了6.06倍，但回收率较低，表明乌鲁木齐春尺蠖酚氧化酶的热稳定性较差。乌鲁木齐春尺蠖多酚氧化酶的最适pH为6.5，最适温度为25 ℃时活性最高，这与一些尺蛾科害虫的多酚氧化酶的性质不同，如槐尺蠖、枣尺蠖、桑尺蠖的多酚氧化酶最适pH均为7.0，最适温度为37 ℃，产生差异的原因可能与酶的来源以及测定的条件不同有关。当温度在45 ℃以上时，乌鲁木齐春尺蠖多酚氧化酶随着保温时间的延长，酶活力下降较为明显，在50 ℃时保温15 min，酶活力下降为原活力的27.3%，在60 ℃时保温15 min，酶趋于失活。

选择3种多元酚作为底物研究春尺蠖多酚氧化酶的底物专一性，结果表明乌鲁木齐春尺蠖多酚氧化酶对邻苯二酚的亲和力最高，对焦性没食子酸的亲和力最低。

明确了沙枣叶中分离的2个单体化合物对春尺蠖多酚氧化酶具有较好的抑制活性，此结果将会进一步指导该类化合物的定量结构活性(QSAR)相关技术研究，以期用于指导开发“昆虫生命活动干扰剂”。