秦皮滴眼液对大鼠干眼模型角膜上皮损害和眼表炎症的疗效观察及机理研究

苏晶，胡锦东，刘新泉，方越，董志国，王大虎

干眼的形成主要受内环境和外环境的影响，外环境主要指人们所处的不利的生活工作职业环境，例如较低相对湿度、较高空气流量环境等。不利的环境因素存在于每个地方，尤其是干旱或半干旱有着温热气候的地区；此外，成千上万的人正处于人工创造的各种不利的环境中，比如空调建筑、车间或飞机舱等[1]，这些环境中的人群往往更容易造成出现干眼相关的症状和表现。

秦皮滴眼液由秦皮和冰片组成，具有祛风明目、清热解毒之功效，是沪上著名中医眼科范新孚教授祖传秘方，同时也是上海中医药大学附属龙华医院长期使用的院内自制试剂，对于干眼引起的眼睛干涩、灼热、痒感、异物感及视疲劳等症状疗效肯定，作用持久且无刺激及副作用[2]。但其作用机制尚不明确。拟通过本次实验评价秦皮滴眼液对单纯环境因素诱导的大鼠干眼模型角膜上皮损害和眼表炎症的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本研究对动物的处理及实验步骤均遵循上海中医药大学及视觉与眼科学研究协会 （association for research in vision and ophthalmology，ARVO） 关于眼科与视觉研究中心动物使用的相关规定和条例。选择60只4～6周龄健康雌性Balb/c大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司。试验前进行角膜荧光素染色（fluorescein staining，FL）检测角膜健康情况，排除有角膜点染、溃疡的大鼠。

以体重为区组因素随机将大鼠分为正常对照组、干眼模型组、秦皮治疗组，每组20只。

1.2 实验方法

1.2.1温控-湿控调节系统建立 参考Chen W等[3-5]提出的方法建立智能环境控制系统（intelligent control environment system，ICES）并对其加以改善创新，通过改装冷风机、隔热材料、防潮材料、密封材料及控温机等建立温控模型房，同时应用2台高级智能除湿机，最终建立起温控-湿控调节系统，使得温度控制在（25.8±1.7）℃、相对湿度（relative humidity，RH）控制在（12.7±0.8）%。

1.2.2造模 正常对照组大鼠饲养于自然环境中，T 24～26℃，RH60%～75%，秦皮治疗组和干眼模型组均饲养于温控模型房中。秦皮治疗组采用微量加液器吸取秦皮滴眼液进行点眼，每日5次，每次2 μl，共28 d，干眼模型组和正常对照组不点眼药水。各组大鼠在饲养期间给予充足饮水、混合饲料及正常日照，2 d更换垫料，保持清洁干燥。

造模成功的标准：与正常对照组比较，出现有统计学意义的泪液分泌量减少即表明干眼造模成功。

1.2.3实验过程 于实验开始前和置于智能环境控制系统后第7 d、14 d、2l d、28 d行酚红棉线试验和泪液蕨样变试验。于第28 d完成上述检查后腹腔内注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行全身麻醉，颈椎脱臼法处死大鼠，取连带上眼睑、下眼睑及完整结膜的眼球，置于4%多聚甲醛中固定。

1.3 酚红棉线试验

酚红棉线 （购自天津晶明新技术开发有限公司），放大镜下使用显微镊夹住酚红棉线转折处，将其置于大鼠下睑结膜囊的中外1/3处，60 s后取出，测量酚红棉线湿润长度并记录数据，以此作为泪液分泌量的评价指标。

1.4 泪液蕨样变试验

无表面麻醉情况下采用毛细玻璃管从内眦部吸取2 μl泪液，取样过程不触及角膜和结膜，以免引起刺激性泪液，将吸取的泪液小心置于干净的载玻片上，26℃环境中待泪液自然干燥，通过光学显微镜观察泪液结晶形态并照相记录。

1.5 病理组织学检查

各组大鼠的眼球沿角膜缘环形剪下角膜和角膜缘外3～4 mm的结膜组织，采用石蜡包埋切片，行病理组织学检查。通过角膜苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，观察角膜上皮细胞学形态。结膜通过过碘酸-雪夫染色法(periodicacid-schiff，PAS)染色观察结膜杯状细胞形态和数目。

1.6 免疫荧光染色法检测CD4＋T细胞的数量

大鼠角膜组织经石蜡包埋后，冰冻切片3 μm，室温放置30 min以上，用4 ℃丙酮固定10 min，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗5 min×3次；3%过氧化氢 （hydrogen peroxide，H2O2）孵育5 min，PBS洗5 min×2次。0.01 mmol/L PBS（PH7.2～7.4）浸洗30 min；1%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）-PBS封闭30 min，倾去；加1:100稀释的CD4+一抗（Abcam公司），置湿盒中4℃过夜；次日拿出湿盒，弃一抗，0.01mmol/LPBS（PH7.2～7.4）冲洗，3 min×3次；滴加1:100稀释Alexa Fluor647标记二抗 （1%BSA-PBS稀释，Abcam公司），37 ℃孵育30 min；弃二抗，0.01 mmol/L PBS（PH7.2～7.4）洗3 min×3次；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染细胞核20 min，PBS洗3 min×3次；缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.7 统计学方法

应用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较用单因素方差分析处理，两两之间比较用Q检验。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酚红棉线试验

采用方差分析进行统计学分析，3组大鼠的泪液分泌量在基点处相近，差异无统计学意义，具有可比性。14 d时干眼模型组出现泪液减少。21 d时干眼模型组大鼠与正常对照组比较泪液分泌量减少，秦皮治疗组泪液分泌量较干眼模型组多，F=9.988，P＜0.05，差异有统计学意义；第28 d时，秦皮治疗组较干眼模型组泪液分泌量增多，F=27.769，P＜0.01，差异具有统计学意义（表1）。

2.2 泪液蕨样变试验

光学显微镜下观察发现，正常对照组从第0 d至第28 d均能观察到大鼠泪液蕨类结晶形态良好；干眼模型组大鼠随着在温控-湿控调节系统中时间的延续，泪液蕨类结晶排列逐渐变得不规则，出现断裂与减少，至第28 d可见蕨类结晶较正常对照组明显稀疏减少，甚至消失；秦皮治疗组在各时间点泪液蕨类结晶形态均较干眼模型组大鼠良好，但不如正常对照组蕨类结晶形态规则、密集。3组大鼠第28 d泪液蕨类结晶形态（图1）。

表1 3组大鼠的酚红棉线试验结果比较（）

表1 3组大鼠的酚红棉线试验结果比较（）

注：* 与同时间点正常对照组比较，P＜0.05；# 与同时间点干眼模型组比较，P＜0.05

图1 3组大鼠第28 d泪液蕨类结晶形态图1A正常对照组，形态完整，连接紧密而无断裂；1B干眼模型组，稀疏有空隙，出现断裂；1C秦皮治疗组，形态良好，排列紧密规则

2.3 病理组织学检查

2.3.1角膜HE染色 第28 d光镜下对3组大鼠角膜行HE染色后可见，正常对照组Balb/c大鼠眼球角膜上皮细胞分层良好，排列规则，基底部细胞呈柱状排列，并且向角膜上皮逐渐分化为鳞状上皮细胞；干眼模型组大鼠经过28 d温控-湿控调节系统造模后角膜上皮细胞出现增生，上皮明显增厚；秦皮滴眼液治疗组结构较为良好，厚度未见明显变化（图2）。

图2 3组大鼠第28 d角膜HE染色后角膜上皮细胞图2A正常对照组，各层细胞排列整齐，分层良好；2B干眼模型组，角膜上皮增生变厚；2C秦皮治疗组，厚度未见明显变化

2.3.2结膜PAS染色第28 d对3组大鼠结膜组织进行PAS染色后于光学显微镜下观察，可见正常对照组大鼠结膜上皮细胞排列规则，杯状细胞形态完好，均匀地分布在上皮细胞间；干眼模型组大鼠结膜杯状细胞数目减少且排列紊乱，杯状细胞密度明显减少；秦皮治疗组大鼠结膜上皮细胞未见明显异常，杯状细胞密度较正常稍微减少（图3）。

图3 3组大鼠第28 d结膜组织PAS染色图3A正常对照组，杯状细胞（黑色箭头）分布均匀，形态完整；3B干眼模型组，杯状细胞计数明显减少；3C秦皮治疗组，杯状细胞（黑色箭头）计数未见明显减少

各组大鼠结膜杯状细胞数量比较：第28 d，干眼模型组大鼠结膜杯状细胞数量(83.9±20.7)个较正常对照组(175.9±33.1)个明显减少；而秦皮治疗组结膜杯状细胞数量(126.2±29.1)个多于干眼模型组，差异均有统计学意义(F=53.598，P=0.000)。

2.4 CD4+T细胞的数量

本研究通过观察免疫荧光染色法检测CD4+T细胞在角膜中的浸润情况，从而反映眼表的炎症程度。实验发现，干眼模型组的大鼠角膜CD4+T细胞浸润明显，而秦皮治疗组未见明显的CD4+T细胞浸润情况（图4）。

图4 3组大鼠第28 d角膜免疫荧光染色图4A正常对照组，CD4＋T细胞（橘红色）浸润可忽略；4 B干眼模型组，CD4＋T细胞（橘红色）浸润显著；4C秦皮治疗组，CD4＋T细胞（橘红色）浸润较干眼模型组少

用药后28 d，干眼模型组大鼠的每张角膜切片中CD4+T细胞数量为（98.6±21.7)个，较正常对照组的CD4+T细胞数量(35.2±9.5)个明显增多；而秦皮治疗组角膜CD4+T细胞数量为(63.4±11.2)个，少于干眼模型组，3组组间差异均有统计学意义(F=88.229，P=0.000)。

3 讨论

目前已经明确了炎症与干眼的发生发展密切相关，基于眼表组织的免疫性炎症是干眼最本质的病理生理改变，目前不少学者致力于中药的免疫调节研究，认为可以通过减少炎性细胞因子释放，减缓杯状细胞凋亡发挥中药治疗干眼的作用[6-8]。现代药理研究表明，秦皮具有抗炎镇痛、抗病原微生物、抗肿瘤、抗凝、抗过敏、抗氧化和清除自由基及止咳平喘、利尿、止汗等作用，其毒性较低而无致突变作用[9]。秦皮中抑制病原微生物的有效成分主要为秦皮甲素和秦皮乙素，各时段不同研究表明秦皮对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、变形杆菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等多种致病菌均有不同程度的抑制作用[10]，秦皮水煎醇沉后制成的浸液具有抗单纯疱疹病毒的作用[11]。其抗炎镇痛作用主要通过降低一氧化氮和可溶性细胞间黏附分子的分泌[12]及抑制基质金属蛋白酶-1、前列腺素水平等调节达成。冰片具有开窍醒神，清热散毒，明目退翳之功效，常为佐使之用，《本草衍义》[13]称之为“独行则势弱，佐使则有功”。樊岚岚等[14]通过离体兔眼角膜实验对冰片的促渗作用进行了分子水平研究，证实了冰片能够通过增加角膜上皮的通透性而有效促进滴眼液中成分进入前房。故对于穿透角膜能力较弱的药物，可予以加入一定浓度的冰片而使药物快速进入前房发挥治疗作用。

本研究通过改装冷风机、隔热材料、防潮材料、密封材料及控温机等建立温控模型房，成功模拟了单纯环境因素诱导的大鼠干眼模型。研究结果表明处于干燥低湿、高气流量环境中的Balb/c大鼠出现了与干眼患类似的临床表现，造模成功。

各种类型的干眼均会造成杯状细胞的损失，杯状细胞一旦损失，由其分泌的凝胶粘蛋白MUC5AC表达水平自然下降[15-16]，从而引起泪膜稳定性下降及加快眼表水样液蒸发，降低泪液的润滑作用，并促发引起眼表损害和炎症。随着干眼的发展，干燥应力诱导了一个基于免疫的持续低度眼表炎症，炎症引起眼表CD4+T细胞和CD11b+单核细胞招募和激活并分泌各种炎性细胞因子[17-18]，实验的干眼模型组CD4+T细胞免疫荧光染色也表现出了明显的浸润情况，而秦皮治疗组CD4+T细胞浸润情况明显好转，显示炎症减少。本次实验通过CD4+T细胞的检测论证秦皮滴眼液对于干眼眼表炎症的抑制作用，为后续深入的机制研究提供基础。