芍药苷对慢性高眼压大鼠RGCs保护作用的研究

张丹，赵军，孙凤江，张娟美，季亚男

青光眼全球发病率约1%～2%[1]，视神经损伤及特征性视野缺损为其主要特征。病理性高眼压是青光眼危险要素之一，但单纯控制眼压并不能完全抑制视神经损害的发展[2]。进行性视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）凋亡是视神经损伤和视功能损害进展的主要因素，RGCs 是青光眼视神经损害的核心[3-4]。因而，RGCs 保护是青光眼治疗的重点。芍药苷（paeoniflorin，PF）是从毛茛科植物芍药/牡丹的根皮中提取的水溶性单萜苷，具有抗炎、抗氧化应激、免疫调节活性及神经保护等作用[5-6]。本研究通过对慢性高眼压大鼠模型进行腹腔注射芍药苷的治疗，初步讨论芍药苷对慢性高眼压模型大鼠RGCs 凋亡的影响及作用机制，以期发现新的保护RGCs 的药物，寻找减轻青光眼视神经侵害新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30 只SPF 级健康雄性SD 大鼠（7～8 周龄）由武汉华联科生物技术有限公司实验室提供，体质量180～210 g，许可批号：SYXK（鄂）2018-0104。所有大鼠均经裂隙灯检查及检眼镜检查。按照国家科学技术部发布的《实验动物管理条例》进行使用。

1.2 主要试剂及仪器

芍药苷（上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%，生产批号：L07M9Q60533）；0.5%盐酸丙美卡因滴眼液（美国爱尔康公司）；左氧氟沙星眼膏（湖北远大天天明制药有限公司，生产批号：H20040234）；TONO-Pen AVIA 眼压计（美国Medtronnic SALON 公司）；HE 染色试剂盒 （Bioswamp，批号：I17091）、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 （ROCHE，批号：11684817910）、HO-1 一抗（HO-1 Max VisionTM，抗体种属：兔，Bioswamp,批号：PAB38338）；兔/鼠聚合物二抗免疫组化试剂盒 （迈新，批号：KIT-5020）、DAB 浓缩型试剂盒（Bioswamp，批号：W1762）。

1.3 方法

1.3.1 分组 按照随机数字表法将30 只SD 大鼠随机分为假手术组，高眼压模型组及芍药苷治疗组，每组10 只，选取右眼为试验眼。

1.3.2 建立慢性高眼压模型采用标准巩膜静脉烧灼法[7]制造高眼压大鼠模型。10%水合氯醛（0.3ml/100mg）腹腔内注射麻醉，随后丙美卡因点眼，1 次/5 min，共3 次。在角膜缘后1.5 mm 处连续剪开6：00～12：00位球结膜，分离结膜下筋膜及肌肉，暴露上直肌两侧及外直肌下方共3 条表浅巩膜静脉总支 （1 点位、8点位、10 点位），用台式电凝笔止血器进行灼烧静脉总支。烧灼处静脉血流消失，近端静脉充血怒张，远端静脉血流消失成一条白线标志烧灼成功。假手术组只剪开球结膜，不处理巩膜静脉。Tono-Pen AVIA眼压计测量眼压，单位为mmHg（1mmHg=0.133 kPa），术后眼压大于术前眼压的1.7 倍即视为造模成功。于造模前及造模后30 min、7 d、14 d 分别测量右眼眼压。测量前10%水合氯醛麻醉，用眼压计测量3次，取其平均值。术毕每日结膜囊内涂左氧氟沙星眼膏。术后治疗组大鼠进行腹腔注射芍药苷（20 mg/kg），其余大鼠腹腔内注射生理盐水0.5 ml，每日1 次，连续2 周。

1.3.3 取材 末次注射后次日，过量麻醉处死，快速摘除右眼球，留取部分球后视神经组织，4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，石蜡包埋备HE 染色、TUNEL及免疫组化用。

1.4 检查指标

1.4.1 苏木素-伊红染色（HE 染色）组织切片脱腊至水化，进行HE 染色，苏木精染液染核，双蒸水终止染色，分化液分化，脱洗，0.5%伊红染色2～3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。高倍镜（×400）观察各组大鼠视网膜的形态结构。每组随机选取10 张切片，取50 μm 视野中的RGCs 区域，计算RGCs 层细胞数量。

表1 各组大鼠造模前后的眼压比较（）

表1 各组大鼠造模前后的眼压比较（）

注:* 与同组术前比较，P＜0.05；# 与同一时间段假手术组比较，P＜0.05

图1 造模后两周各组大鼠视网膜组织HE 染色（×400）。1A 假手术组大鼠视网膜构造规整，层次清晰，细胞整齐排列，单层视网膜神经节细胞外形规则，内、外核层排列整齐；1B 高眼压模型组大鼠视网膜构造紊乱，视网膜神经节细胞数目减少，排列错乱，形状不规则，可见部分细胞核裂解、变性，内、外核层轻度水肿，排列疏松；1C 芍药苷组大鼠视网膜各层构造尚规整，层次明晰，视网膜神经节细胞排列尚规整，形状较规则，内、外核层排列稍紊乱

图2 造模后两周各组大鼠视网膜组织TUNEL 染色（×400）。2A 假手术组；2B 高眼压模型组，箭头指凋亡细胞；2C 芍药苷治疗组。箭头指凋亡细胞

1.4.2 TUNEL 检测 组织切片常规脱腊至水化，常规进行TUNEL 染色,组织切片常规脱腊至水化，蛋白酶K 孵育15 min，TUNEL 反应混合液孵育60 min，PBS 冲洗3 次，DAB 孵育10 min，苏木素复染。高倍显微镜下（×400）观察并拍照，棕色细胞核为凋亡细胞,每张切片随机选取3 个视野，分别计数每个视野中阳性着色细胞数，取平均值。

1.4.3 视网膜组织血红素加氧酶-1 （Heme oxygenase-1，HO-1）免疫组化染色 组织切片常规脱腊至水化；0.05 mol/L 枸橼酸钠缓冲液（PH=6.0）微波修复抗原；自然冷却后PBS 清洗3 次，3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性10min；10%山羊血清室温封闭30 min；相继加入一抗，4℃过夜；室温复温40 min；Maxvision 二抗37℃作用30 min；DAB 显色，苏木素复染。高倍显微镜下（×400）根据染色强度进行评定：淡黄色，即弱阳性；棕黄色，即阳性；棕褐色，即强阳性。应用image pro-plus 6.0 图像系统进行图像分析，以阳性染色细胞平均光密度值作为HO-1阳性表达水平。

1.5 统计学方法

运用SPSS 25.0 统计学软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（）描述，比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 眼压测量

造模前，3 组眼压比较无统计学意义 （F=1.191,P=0.319）；造模后30 min，模型组及芍药苷组眼压均较之前升高，造模成功（t模型组=-25.086，t芍药苷组=-24.912,均P=0.000）；造模后1 周、2 周，高眼压模型组与芍药苷治疗组眼压均较假手术组升高（F1周=388.43，F2周=281.504，均P=0.000）；造模后，模型组与芍药苷治疗组眼压无统计学意义（F=1.223，P=0.283）。

2.2 大鼠视网膜HE 染色

与假手术组（17.0±2.67）个/视野比较，模型组（8.5±2.07）个/视野及芍药苷治疗组（12.5±1.72）个/视野，RGCs 层细胞数量均减少（t模型组=7.965，t芍药苷组=4.488，均P=0.000），但芍药苷治疗组RGCs 层细胞数量高于模型组，差异具有统计学意义（t=-4.407，P=0.000）（图1）。

2.3 TUNEL 检测大鼠RGCs 凋亡

假手术组大鼠视网膜RGCs 层未见细胞凋亡；模型组大鼠RGCs 层凋亡细胞增多，（12.1±1.52）个/视野，且内、外核层也可见少量凋亡细胞；芍药苷治疗组大鼠RGCs 层TUNEL 阳性细胞少量表达，（5.3±1.7）个/视野，与模型组相比，具有统计学意义（t=9.410,P=0.000）（图2）。

2.4 大鼠RGCs 中HO-1 的表达

HO-1 主要定位于细胞质中，散见于胞核中，阳性细胞呈片状散布的棕褐色颗粒（图3）。假手术组HO-1 蛋白平均光密度值为（0.45±0.13），高眼压模型组HO-1 蛋白平均光密度值（0.5±0.3），芍药苷治疗组HO-1 蛋白平均光密度值（0.74±0.19）。3 组光密度值差异有统计学意义（F=6.657,P=0.004）。两两比较，模型组与假手术组比较无统计学意义（t=-1.05,P=0.31），但芍药苷治疗组则平均光密度值高于模型组（t=-2.306,P=0.017），有统计学意义。

3 讨论

青光眼为全球第一大不可逆致盲性眼病[1]，尤其是亚洲后裔，并有一定的遗传倾向。病理性高眼压是青光眼危险因素之一，但单纯降低眼压并不能有效控制视神经病变的进展。青光眼是一种视神经变性类疾病，其发病核心是RGCs。RGCs 进行性凋亡是视神经损伤的主要要素。因此，加强预防和治疗视神经损伤尤为重要。

图3 造模后两周各组大鼠视网膜组织HO-1 蛋白表达免疫组化（×400）。3A 假手术组HO-1 蛋白弱阳性表达；3B 高眼压模型组HO-1 阳性表达增多，着色加深；3C 芍药苷治疗组HO-1 蛋白表达比模型组表达数量多，着色更深，强阳性表达进一步增多。HO-1：血红素加氧酶-1

氧化应激在发展和加速青光眼视神经损伤中起关键作用[8]。氧化应激反应升高，视网膜自由基增加，使线粒体功能异常，能量代谢异常，导致视网膜神经节细胞的凋亡，同时自由基还可直接攻击细胞的DNA，加快细胞凋亡[9]。在Liu Q 等[10]的实验中，发现氧化应激状态下HO-1 在视网膜神经节细胞中的表达增多。在高眼压状态下，大鼠视网膜内活性氧产生增多和脂质过氧化增加等[11]，为响应氧化损伤，机体会调动抗氧化系统。HO-1 是体内分布最普遍的抗氧化酶之一，其一方面可阻止游离血红素参与氧化反应，另一方面可通过其降解产物（胆红素、CO、铁离子）发挥抗氧化应激、抗炎、抑制凋亡和改善组织微循环的作用[12]。在本次实验中，模型组HO-1 表达轻度上调主要是机体自身抗氧化系统激活的结果。HO-1相关通路的激活显著降低慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的凋亡和损伤，从而起到保护作用[13-14]。

芍药苷是从毛茛科植物芍药或者牡丹的根皮中提取的一种水溶性单萜苷，主要应用于神经系统或者神经退行性疾病，近年其抗炎、抗氧化应激、免疫调节活性等作用受到越来越多的关注。芍药苷能下调活性氧、NO、H2O2、Ca2+等物质，抑制氧化亢进，并能活化Nrf2 等抗氧化通路，上调Nrf2 等因子及其下游抗氧化酶（HO-1）的水平[15-16]，保护细胞免受氧化损伤。芍药苷能降低大鼠血糖及抑制胶质细胞活化,上调视网膜GLAST、GS 表达，降低视网膜谷氨酸含量，对糖尿病大鼠视网膜Müller 细胞具有保护作用[17]。另外，已有实验证实芍药苷在急性高眼压模型中可通过抑制NLRP3 炎症小体信号通路保护视网膜[18]。在本次实验中，我们发现芍药苷在慢性高眼压大鼠模型中能够通过上调HO-1 的表达减少视网膜神经节细胞的凋亡。

综上所述，本次实验初步证明在慢性高眼压大鼠模型中，芍药苷可抑制RGCs 的凋亡，其保护效应可能是通过上调HO-1 表达实现的。HO-1 相关通路的激活减轻RGCs 凋亡与损伤，将为青光眼发病机制—氧化应激学说提供支持证据，也确定了芍药苷的视神经作用机制。这将对于挽救视网膜神经节细胞的凋亡提供新的途径和作用靶点。