不同碳氮营养对猴头菌胞外酶活性的影响

赵长江，张亚洁，龚教龙，于晶，赵志莹，阮航，范博文，李佐同

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆163319；2.黑龙江省秸秆资源化利用工程技术研究中心；3.黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室；4.黑龙江省普通高校寒地作物种质改良与栽培重点实验室）

食用菌在整个生命过程中会产生多种酶，有些在菌丝体内起作用称为胞内酶，而有些酶被分泌到细胞外将有机物料分解为小分子物质供菌丝生长发育吸收利用，称为胞外酶。食用菌胞外酶主要有纤维素酶、木质素酶、淀粉酶等多酶体系，其中纤维素酶主要包括有羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等，过氧化物酶和漆酶是木质素酶的重要组成部分[1-4]。

食用菌胞外酶的种类、活性与培养基或培养料组成密切相关[5-6]，而且通过对蜜环菌、黄伞、元蘑、香菇等食用菌在不同培养料和不同生长发育阶段所分泌的胞外酶活性分析，指出胞外酶活性与生长发育阶段密切相关，并且呈现阶段性变化，培养料的不同对胞外酶活性的变化趋势影响小，但是对其活性影响较大[7-11]。其中，吴周斌等[3]研究指出不同培养料中真姬菇菌丝分泌的同种胞外酶，其活性在各生长发育阶段不同，真姬菇菌丝分泌的木质素酶类（漆酶、锰过氧化物酶）活性最大值都在菌丝后熟阶段，而非木质素酶活性最大值则都在菌丝生殖阶段。方宏阳等[12]通过玉木耳及自交系菌株不同时期胞外酶活性与农艺性状关系的研究表明，出耳周期与菌丝生长至培养料1/4 处到菌丝透壁前的羧甲基纤维素酶活呈正相关，产量与后熟期的漆酶活性呈负相关，与采收结束期的羧甲基纤维素酶活呈正相关，与菌丝透壁前的蛋白酶活性呈正相关。韩增华等[13]通过对黑木耳10 个菌株胞外酶活性及与栽培性状和产量的关系研究指出，胞外漆酶、多酚氧化酶活性的变化趋势大致相似，酶活性与栽培产量呈正相关。王宜磊[14]通过对彩绒革盖菌木质纤维素酶和木质素酶活性分析，指出供试培养料中麸皮和酵母膏是该菌最适的碳、氮营养。上述研究表明，食用菌胞外酶活性大小、动态变化规律可以反映出食用菌微生物的生长发育状态以及培养料的配比等农艺形状和操作要求，从而为食用菌栽培料配方及栽培管理提供理论指导。

猴头菌是我国珍贵的、食药兼用的腐生真菌[15-18]。但是，关于该类食用菌对于不同碳氮营养的响应情况至今鲜有报道，研究通过对8 种碳源和8 种氮源营养的液体培养猴头菌的6 种胞外酶活性进行解析，以期揭示猴头菌营养生长的碳、氮利用规律，为猴头菌生产栽培料的添加组配、栽培过程管理，以及食用菌产量品质的调控提供理论指导和借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

猴头菌（Hericium erinaceus）菌株RT22，由黑龙江省农业科学院牡丹江分院提供。

1.2 试验设计

1.2.1 培养试验

无菌条件下，将活化的菌种切割成0.5 cm2大小的菌丝块，每瓶接3 块菌丝块，于180 rpm 摇床25 ℃培养8 d。每个处理3 次重复。

1.2.2 培养基配制

基础培养基：葡萄糖30.0 g，酵母膏10.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.6 g，定容至1 L。

不同碳源培养基：分别加入麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素和阿拉伯胶替代葡萄糖，浓度均为30 g·L-1。

不同氮源培养基：分别加入苯丙氨酸、谷氨酰胺、硝酸钾、硝酸铵、尿素、硫酸铵和蛋白胨替代酵母膏，浓度均为10 g·L-1。

1.3 指标测定

1.3.1 羧甲基纤维素酶活性测定

取0.5 mL 培养液（酶液）和1.5 mL pH 4.6 的羧甲基纤维素钠溶液混合，置40 ℃水浴锅保温30 min。沸水浴15 min 后，取0.5 mL 用DNS 法测还原糖生成量。用紫外分光光度计在540 nm 波长处测定光密度值[19]。

1.3.2 半纤维素酶活性测定

将0.5 mL 酶液和1.0 mL 1%的木聚糖溶液混匀后，在50 ℃水浴锅保温1 h，取出加入2.0 mL DNS试剂，煮沸5 min，定容至20.0 mL。以煮沸灭活的酶液作对照，用紫外分光光度计在540 nm 波长处测定光密度值[19]。

1.3.3 淀粉酶活性测定

将0.5 mL pH 为5.6，0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液和0.5 mL 酶液混合匀后40 ℃水浴15 min，加入预热的1%可溶性淀粉1.0 mL 混匀，40 ℃水浴5 min。加入2.0 mL 0.4 mol·L-1NaOH。取混合溶液2.0 mL 和2.0 mL DNS 试剂，煮沸5 min，冷却后定容至25.0 mL，用紫外分光光度计在520 nm 波长处测光密度值[19]。

1.3.4 滤纸纤维素酶活性测定

裁剪长宽为1.0 cm × 6.0 cm 的新华定量滤纸条和0.5 mL 酶液（稀释5 倍的粗酶液）放入刻度试管中混匀后在50 ℃水浴锅保温30 min，取出再加1.5 mL DNS 试剂，煮沸5 min，取出待冷却后加入蒸馏水定容至20.0 mL，以煮沸灭活的酶液作对照，用紫外分光光度计在540 nm 波长处测定光密度值[19]。

1.3.5 漆酶活力测定

将0.5 mL，0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液（pH 5.6）和0.5 mL 酶液（稀释5 倍的粗酶液）加入到刻度试管中，混匀后在40 ℃水浴锅中保温15 min，然后再加入预热的1%可溶性淀粉1.0 mL，混匀，在40 ℃水浴锅中保温5 min，加入2.0 mL，0.4 mol·L-1NaOH 用来终止反应。取混合溶液2.0 mL 和2.0 mL DNS 试剂加入到刻度试管中，煮沸5 min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25.0 mL，用紫外分光光度计在520 nm 波长处测光密度值[19]。

1.3.6 过氧化物酶活性测定

在50.0 mL 0.1 M 的磷酸缓冲液（pH6.0）试管中，分别加入由过氧化氢28.0 μL 和愈创木酚19.0 μL，取混合物3.0 mL 和粗酶液1.0 mL 混合均匀，用紫外分光光度计在504 nm 波长处测光密度值[19]。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2016 进行数据整理及分析，利用SPSS Statistic 21.0 对所得数据进行单因素方差检验，差异显著性及多重比较分析采用Duncan 检验法处理，图表数据均为3 次或3 次以上重复处理的平均值。

2 结果与分析

2.1 不同碳氮对猴头菌分泌羧甲基纤维素酶活性的影响

不同碳源和氮源处理的猴头菌羧甲基纤维素酶活性变化如图1 所示。在不同碳源处理下，葡萄糖碳源培养菌羧甲基纤维素酶活性最强（10.69 U），显著高于麦芽糖处理（6.76 U），与其他处理差异不显著，而且其余6 个供试碳源间该酶活性差异也不显著；在不同氮源处理下，所有处理的猴头菌羧甲基纤维素酶活性差异不显著（8.01 U～11.48 U）。结果表明，碳源对猴头菌羧甲基纤维素酶活性影响明显，氮源对该酶活性影响不明显。

图1 不同碳氮培养基中猴头菌羧甲基纤维素酶活性Fig.1 CMCase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.2 不同碳氮对猴头菌分泌滤纸纤维素酶活性的影响

不同碳源和氮源处理的猴头菌滤纸纤维素酶活性变化如图2 所示。在不同碳源处理下，葡萄糖（7.09 U）、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素和阿拉伯胶等6 个碳源对猴头菌滤纸纤维素酶活性影响相近，处理间差异不显著，其中葡萄糖和果糖培养酶活性显著高于蔗糖和乳糖处理。在不同氮源处理下，苯丙氨酸与尿素氮源滤纸纤维素酶活性差异不显著，其中苯丙氨酸处理酶活性最强（11.78 U），显著高于其他处理；硝酸铵处理酶活性最弱（3.36 U），显著低于供试的其他氮源。结果表明，碳源和氮源都可以引起猴头菌滤纸纤维素酶活性显著变化。

图2 不同碳氮培养基中猴头菌滤纸纤维素酶活性Fig.2 Filter paper cellulase activityof H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.3 不同碳氮对猴头菌分泌半纤维素酶活性的影响

不同碳源和氮源处理的猴头菌半纤维素酶活性变化如图3 所示。在不同碳源处理下，葡萄糖碳源培养该酶活性最高（1.19 U），显著高于其余7 个碳源。在不同氮源处理下，尿素、苯丙氨酸、硝酸钾、硝酸铵和硫酸铵等5 个供试氮源间猴头菌半纤维素酶活性差异不显著，但都显著高于谷氨酰胺处理（0.84 U）。结果表明，碳源和氮源都可以引起猴头菌半纤维素酶活性显著变化，氮源对该酶影响更大。

图3 不同碳氮培养基中猴头菌半纤维素酶活性Fig.3 Hemicellulase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.4 不同碳氮源对猴头菌分泌淀粉酶活性的影响

不同碳源和氮源处理的猴头菌淀粉酶活性变化如图4 所示。在不同碳源处理下，葡萄糖（0.27 U）、果糖、麦芽糖、纤维素、阿拉伯胶等5 种碳源对猴头菌淀粉酶活性影响相近，显著高于蔗糖、乳糖和淀粉处理；其中阿拉伯胶处理该酶活性最强（0.29 U），淀粉处理酶活性最弱（0.14 U）。在不同氮源处理下，硝酸铵处理的猴头菌淀粉酶活性最强（0.49 U），显著高于蛋白胨、酵母膏、尿素、苯丙氨酸和谷氨酰胺等5 个氮源；硫酸铵与硝酸钾和尿素处理的该酶活性间无显著差异，其中蛋白胨处理的猴头菌淀粉酶活性最弱（0.28 U）。结果表明，碳源和氮源都可以引起猴头菌淀粉酶活性显著变化，氮源对该酶影响更复杂。

图4 不同碳氮培养基中猴头菌淀粉酶活性Fig.4 Amylase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.5 不同碳氮对猴头菌分泌漆酶活力的影响

不同碳源和氮源处理的猴头菌漆酶变化如图5所示。在不同碳源处理下，阿拉伯胶与果糖处理的猴头菌漆酶活性差异不显著，二者显著高于麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉和葡萄糖处理，其中阿拉伯胶处理酶活性最强（4.33 U），显著高于其他所有处理；乳糖和淀粉处理猴头菌漆酶活性无显著差异，均显著低于其他所有碳源处理，其中淀粉处理的猴头菌漆酶活性最弱（0.25 U）。在不同氮源处理下，硝酸铵（4.75 U）、苯丙氨酸（4.58 U）、尿素（4.08 U）和硝酸钾（3.71 U）处理无显著差异，蛋白胨、酵母膏、谷氨酰胺和硫酸铵处理的猴头菌漆酶活性间也无显著差异，前4 个氮源处理猴头菌漆酶活性显著高于后4 个氮源处理。结果表明，碳源和氮源都可以引起猴头菌滤纸纤维素酶活性显著变化，碳源对该酶影响更复杂。

图5 不同碳氮培养基中猴头菌漆酶活性Fig.5 Laccase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.6 不同碳氮对猴头菌分泌过氧化物酶活性的影响

不同碳源和氮源处理的猴头菌过氧化物酶活性变化如图6 所示。在不同碳源处理下，麦芽糖、蔗糖、纤维素处理间无显著差异，显著高于其他5 个处理；而且5 个处理间该酶活性也无显著差异；其中蔗糖处理酶活性最强（0.46 U），葡萄糖处理酶活性最弱（0.13 U）。在不同氮源处理下，谷氨酰胺与硫酸铵、硝酸铵处理的猴头菌过氧化物酶活性差异不显著，显著高于其他处理；其中谷氨酰胺处理的猴头菌过氧化物酶活性最强（0.30 U），硝酸钾处理的猴头菌过氧化物酶活性最弱（0.06 U）。

图6 不同碳氮培养基中猴头菌过氧化物酶活性Fig.6 Peroxidase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

3 讨论

大量研究表明，食用菌胞外酶的种类、活性不仅与食用菌的生长发育阶段密切相关，也与培养基或培养料配方组成密切相关，其中胞外酶的活性变化较为明显[5-13]。研究中，除供试氮源对羧甲基纤维素酶活性影响不显著外，供试的8 种碳源和8 种氮源对供试的6 种胞外酶活性均产生显著影响。在不同碳源中，羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶和半纤维素酶活性在葡萄糖处理下最强，淀粉酶和漆酶活性在阿拉伯胶处理下最强，过氧化物酶活性在蔗糖处理下最强；在不同氮源中，羧甲基纤维素酶活性在蛋白胨处理下最强，滤纸纤维素酶活性在苯丙氨酸处理下最强，半纤维素酶活性在尿素处理下最强，淀粉酶和漆酶活性在硝酸铵处理下最强，过氧化物酶活性在谷氨酰胺处理下最强。其中，蛋白胨是猴头菌羧甲基纤维素酶活性最适氮源的结果与贾素巧[19]的研究结论相佐证。

上述结果表明，供试16 种碳氮源的液体培养中，不同胞外酶最大活性的最适碳源和氮源不尽相同，而且，氮源对供试胞外酶活性影响要高于供试碳源。基于胞外酶高活性指标的综合考虑，猴头菌液体培养最适培养基配方的碳源可优先选择葡萄糖，这与赵占国等[20]研究指出的猴头菌栽培最适碳源为葡萄糖的结论一致；猴头菌最适培养基配方中的营养元素氮源可优先选择硝酸铵。荆瑞勇等[21]通过正交试验设计对金针菇胞外多糖液体发酵培养基碳源和氮源进行优化的研究中也指出硝酸铵0.5%是该菌最适的配方之一。此外，我们可以在食用菌栽培过程中添加不同碳源或氮源，来激发某些或某类胞外酶活性，从而提高其生物学效率，宋琪等[22]在金针菇的培养料中添加尿素能明显提高金针菇的绝对生物学效率，我们推测可能与尿素有助于提高半纤维素酶活性有关。

4 结论

葡萄糖碳源培养基中猴头菌羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶和半纤维素酶活性最高，上述纤维素酶类活性最适氮源分别为蛋白胨、苯丙氨酸、尿素；淀粉酶活性最高的碳源为阿拉伯胶，葡萄糖淀粉酶活性与阿拉伯胶相近，该酶的最适氮源为硝酸铵。猴头菌漆酶和过氧化物酶的最适碳源分别为阿拉伯胶和蔗糖，最适氮源分别为硝酸铵和谷氨酰胺。上述结果表明，以结构性或组成性物质为底物的纤维素酶活性最适碳源相对稳定，受氮源影响较大；猴头菌氧化酶类活性受底物影响较大，可能与该类酶易受环境影响有关。研究在液体培养环境下揭示了猴头菌对碳氮营养的利用规律，可为该类食用菌生产栽培料的添加组配和栽培管理提供理论指导和借鉴。