贵州省新型冠状病毒核酸检测质量现场考核结果分析

吴 娴，冯勤颖，向 丽，黄 山，王济林，孙建超，陶永德

贵州省临床检验中心，贵州贵阳 550002

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的，确诊的金标准是可在患者体内检测到SARS-CoV-2，而核酸检测是检测病毒基因中的某些特定核酸序列，因此从方法学层面考虑可将其作为实验室诊断金标准[1]。ZHU等[2]在2020年1月通过高通量测序已证实SARS-CoV-2为一种β属冠状病毒，其基因组约含29 000个碱基，有12个蛋白编码区/开放读码框(ORF)，包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14；其中ORF 1ab编码RNA聚合酶，可参与病毒核酸复制；N区编码核壳蛋白，其与病毒基因组宿主RNA互相识别；E区编码囊膜蛋白，与病毒包膜及病毒颗粒的形成相关[3-4]。

近期，SARS-CoV-2核酸检测阳性率问题备受社会关注。贵州省为了切实做好“外防输入、内防扩散”工作，及时有效发现和控制传染源，规定了对五类人员(疑似病例、确诊病例的密切接触者、每天发热门诊就诊的发热患者、湖北省武汉市等地返黔的居家隔离和集中隔离人员、每天由湖北省武汉市等地新来黔或返黔人员)开展全面核酸检测。贵州省卫生健康委员会在原来的10家疾控中心检测实验室的基础上，新增21家医疗机构和3家第三方检验机构实验室，作为全省SARS-CoV-2核酸检测指定实验室，共计34家。为保证检测结果，了解各实验室检测能力以及检测试剂的质量状况，贵州省临床检验中心针对省内34家SARS-CoV-2核酸检测实验室进行了技术考核，现将相关结果汇报如下。

1 材料和方法

1.1材料 本次考核品定制于相关生物制品公司，共有10批考核品，包括阴性、弱阳性和阳性样品。阴性样品为稀释液；阳性样品采用装甲RNA技术，将3个目标RNA序列(含ORF 1ab、N和E基因)用噬菌体蛋白外壳加以包裹形成，其结构类似于天然病毒，以还原真实的样品，然后进行培养，获得培养液，对收获的假病毒培养液进行初步定值，然后用阴性稀释液稀释至所需水平；弱阳性样品病毒拷贝数为所用6种试剂盒检测限均值的3～5倍。阳性样品大约为105拷贝/毫升，规格:1.0 毫升/管。所用考核样品由专人按照冷藏条件送到各检测实验室，在事先不通知的情况下，在规定时间进行检测和回报。

1.2方法

1.2.1试剂盒 本次考核一共涉及6个不同厂家生产的国产试剂盒，分为A～F 6组，其中A～E组检测位点为ORF 1ab和N基因，F组除这2个基因外，还检测E基因，6种试剂中，除一种使用一步法外，其余均用磁珠法进行病毒核酸提取，且6种试剂均采用荧光定量PCR法对靶基因进行检测。

1.2.2检测方法 各实验室严格按照《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)》[5]和《国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)的通知》[6]相关文件进行生物安全防护和实验操作，并严格按照试剂说明书进行RNA的提取及扩增检测。

1.3统计学处理 采用SPSS23.0进行统计学分析。

2 结 果

2.1各检测机构考核品检测结果与预期结果的符合程度 本次考核发放考核样品34份，每份含10个样品(3个阴性样品，2个弱阳性样品，5个阳性样品)，规定时间内回收结果30份。在完成考核的30家检测机构中，有22家使用试剂A，4家使用试剂B，试剂C、D、E和F各有1家实验室选用。结果共涉及6个厂家试剂，且使用各试剂厂家检测的结果均与预期结果100%相符。这30家检测机构的检测结果总符合率为100%，其中阳性样品符合率、阴性样品符合率、全省疾控机构总符合率、全省医疗机构总符合率、第三方机构总符合率均为100%。考核结果见表1。

表1 各试剂检测结果

2.26组试剂检测结果 本次完成考核的实验室中，22家使用试剂A，4家使用试剂B，其余实验室均只涉及一个厂家试剂，所用考核品10批，且每家实验室均完成了这10批考核品的检测，其检出结果见表2。由表可知，除1组试剂检测ORF 1ab、N和E基因外，其余5组均检测ORF 1ab和N基因，且各组试剂对靶基因的检出率均为100%。

表2 6组试剂检测结果

注：检测次数为使用该试剂的实验室数与考核品批数(10)的乘积。

表3 试剂A、B检测结果平均Ct值均值及CV

注：-为无数据。

2.3不同试剂检测结果平均循环阈值(Ct)值及Ct值变异系数(CV) 本次完成考核的实验室中，22家使用试剂A，4家使用试剂B，其余实验室均只涉及一个厂家试剂，故本次考核只对试剂A和试剂B进行统计分析。试剂A和试剂B的检测结果Ct值均值及Ct值CV见表3。结果显示,试剂A、B检测结果的Ct值均值相差不大，但试剂A检测结果的CV值波动较小，在9%～12%之间，而试剂B检测结果的CV值波动较大，在6%～18%之间，由此可见，试剂A的批间重复性较试剂B要好。在弱阳性样品202002和202006的检测中，试剂B的重复性均较试剂A好。

3 讨 论

近期在湖北省武汉市出现的COVID-19，有极强的传染性，引起了全国乃至世界的广泛关注[7-8]。确诊COVID-19的金标准是SARS-CoV-2核酸检测。

核酸检测结果的准确性涉及患者疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、样品检测等多过程。本次考核，只针对样品检测，包括核酸提取、扩增体系、人员操作、室内质控等因素，即检验中的质量管理。本次考核所涉及的34家SARS-CoV-2核酸检测实验室，是由省级卫生健康委员会指定，有5家医疗机构实验室通过了ISO15189认可，1家疾控实验室通过了ISO17025认可。这些医疗机构实验室，包括第三方实验室，经过多年的实践，在质量管理方面均有丰富的经验，一些没有通过认可的实验室，基本也是参照相关质量管理体系进行质量管理。同时，对于国家或者省级临床检验中心开展了室间质评的项目，几乎所有的实验室都参加了相关项目的室间质评，保障了检验质量。

本次考核的考核品包括阴性、弱阳性和阳性样品。阴性样品为稀释液，阳性样品采用装甲RNA技术，将3个目标RNA序列(含ORF 1ab、N和E基因)用噬菌体蛋白外壳加以包裹，其结构类似于天然病毒，以还原真实的样品，本文所用的阳性或弱阳性考核品具有蛋白外壳，因此可作为抑制质控品，与临床标本相似，可直接作为待测样本进行检测，全程模拟病毒裂解、RNA提取、逆转录以及扩增的整个过程，这是采用裸露的质粒DNA或RNA片段作为质控品所无法比拟的。且采用装甲RNA技术制备的考核品具有稳定、不易被RNA酶降解、无生物安全问题、无传染危险性、可准确定量等优点。

21家医疗机构中，其中20家为三甲医院，1家为三级医院。参与的30家检测实验室，均建立了完整的质量管理体系，严格按照操作规程和室内质控规则进行实验室检测。所以在这次的SARS-CoV-2核酸检测中，才能够出现100%的符合率。

在回报的30家检测实验室中，用于考核样品检测的试剂一共来自6个厂家，并且主要集中在传统的2家基因试剂厂家上，占87%左右，说明我国传统试剂生产厂家的产品质量是过硬的。本次完成考核的实验室中，22家使用试剂A，4家使用试剂B，其余实验室均只涉及一个厂家试剂，每家实验室均完成了这10批考核品的检测，所使用的6个厂家试剂中，除1家试剂的检测位点为ORF 1ab、N和E基因外，其余5家检测位点均为ORF 1ab和N基因，且各组试剂对各基因的检出率均为100%。专家认为，理论上SARS-CoV-2的mRNA转录模式与SARS类似，细胞中SARS-CoV-2的mRNA是病毒基因组RNA的数倍，且在转录时会形成不同长度的mRNA片段，这些mRNA片段均含有N基因，而只有少数mRNA片段含有ORF 1ab基因，因此临床样本中N基因的拷贝数远远高于ORF 1ab，而目前的试剂盒主要检测细胞内的病毒mRNA，因此N基因的检测阳性率要高于ORF 1ab基因；再者，N基因保守程度不及ORF 1ab基因，故少数样本可能与其他类型冠状病毒的核酸序列存在交叉而导致N基因扩增阳性而ORF 1ab基因阴性[9]。本次考核中，各试剂对ORF 1ab基因和N基因的检出率均为100%，这可能与阳性样品中这2个基因的水平相当及其稳定性较临床标本高有关。

本次考核发现，与试剂B相比，试剂A具有较好的批间重复性。而6种试剂的检出率均为100%，说明目前临床关注的SARS-CoV-2核酸检出率低的问题，与试剂盒检出率大小关系不大，但部分试剂的稳定性较差，因而各厂家试剂盒检测性能有待进一步优化。临床检验全面质量管理，其中的分析前质量管理极其重要，患者疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输等，对检测阳性率有着决定性作用。笔者认为，对于社会关注的SARS-CoV-2核酸检测阳性率低的问题，主要是由患者疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输等问题引起。加强与临床和疾控采样人员的沟通和联系，共同对分析前进行质量管理，以保障检验质量，其意义非常重要。

对于贵州省临床检验中心组织的这次现场考核，由于时间紧，任务重，还存在许多不足之处，比如未对考核样品的一致性和稳定性进行验证，对于考核品的定值是采用本实验室仪器进行的，其准确性可能存在一定的误差。各检测实验室对这次考核非常重视，有的实验室进行了2次及以上的检测，未能体现其真实检测水平，也是造成全部符合的原因之一。尽管在研究中采取了装甲RNA技术制备考核样品，但是假病毒中只包含了ORF 1ab、N和E 3个目标RNA序列，与真实病毒有着很大的差别，相对于真实病毒的核酸提取要容易得多。由于考核样品是无感染性的，在检测过程中没有要求灭活，所以对于临床标本检测过程中的灭活过程，是否会对检测结果产生影响，还有待验证。