肠道细菌弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌对斑翅果蝇生长发育和物质代谢的影响

高欢欢, 覃冬云, 代晓彦, 刘 洁, 于 毅,*

(1. 山东省葡萄研究院, 济南 250100; 2. 山东省农业科学院植物保护研究所, 济南 250100)

自然界的昆虫在种群间竞争过程中，同类昆虫会进化分享不同的生态位，以至于有些昆虫种类为了生存而必须适应并非最佳的生态位(Poisotetal., 2011)。斑翅果蝇Drosophilasuzukii隶属双翅目(Diptera)果蝇科(Drosophilidae)果蝇属Drosophila，具有与其他果蝇生态位分离的特点。绝大部分果蝇喜爱于腐烂果实上产卵，腐烂果实中滋生的大量微生物富含丰富的蛋白质，为果蝇幼虫的发育提供了重要的营养(Becheretal., 2012)。而斑翅果蝇则利用其坚硬镰刀状的产卵器，直接刺破果皮将卵产于刚刚成熟的果皮下，卵孵化后以幼虫蛀食为害，果实逐渐软化以致变褐腐烂(Goodhueetal., 2011; Milanetal., 2012)。新鲜水果中糖类和其他碳水化合物较多，蛋白质和氨基酸则相对缺乏，因此斑翅果蝇作为一种典型的生态位转变的物种(Atallahetal., 2014)，需要适应营养上的劣势。

大量研究证明，昆虫肠道中的共生菌可参与寄主的能量与代谢的平衡，为宿主昆虫的生长发育和繁殖提供所需要的营养成分，弥补昆虫自身代谢的缺陷(Douglas, 2009)。例如，橄榄果蝇Bactroceraoleae为适应蛋白质和游离氨基酸含量极度不平衡的橄榄，在消化系统增生了一种囊状结构，在食物中蛋白质含量较少时，可将储存的共生细菌释放至食道和中肠，通过相关代谢途径补充其发育繁殖所需要的游离氨基酸和蛋白质(Ben-Yosefetal., 2010)。黑腹果蝇成虫肠道微生物中的醋酸菌可参与果蝇体内乙醇、醋酸的代谢，产生的次级代谢产物有利于果蝇的生长发育(Ryuetal., 2008; Shinetal., 2011; Fischeretal., 2017)。由此可知，共生微生物是通过调节寄主的代谢通路以及由此产生的代谢物来影响寄主的生长发育，但未见肠道细菌参与斑翅果蝇代谢过程的相关报道。

斑翅果蝇与其他果蝇的生态位和取食条件均不同，肠道中的微生物多样性也会发生相应变化。经过传统分离培养和鉴定，发现不同发育阶段的斑翅果蝇肠道内比较稳定的细菌种类为弗氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii、产酸克雷伯菌Klebsiellaoxytoca、金黄杆菌属Chryseobacteriumsp.、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillusfusiformis和醋酸菌Acetobacterthailandicus(高欢欢等, 2019)。斑翅果蝇取食后的葡萄中也发现了弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯菌(高欢欢等, 2017)。另外，弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌在多种昆虫的肠道中均属于丰富度相对较高的物种。例如，Yong等(2019)研究表明产酸克雷伯氏菌在南亚3个瓜实蝇Zeugodacuscucurbitae地理种群肠道中的相对丰富度均在10%以上;在瓜实蝇中肠中，克雷伯氏菌和柠檬酸杆菌均占较高比例，分别为19.2%和7.7% (Hadapadetal., 2016)。葱地种蝇Deliaantiqua、西方蜜蜂Apismellifera、橘小实蝇Bactroceradorsalis等昆虫中也含有大量的柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌(Guoetal., 2017; Fasasi, 2018; Zhouetal., 2019)，说明这两种细菌与昆虫之间的关系极为密切，但弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌与斑翅果蝇之间的关系未见相关报道。

因此，本研究选择斑翅果蝇与葡萄中相互传递和共生的弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯菌饲喂斑翅果蝇，观察斑翅果蝇生长发育及幼虫体内代谢物含量和抗氧化酶活性的变化，从而为明确两种菌参与斑翅果蝇代谢过程的机制提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和斑翅果蝇

弗氏柠檬酸杆菌C.freundi和产酸克雷伯氏菌K.oxytoca菌株为山东省葡萄研究院自存的菌株。斑翅果蝇来源于山东省农业科学院植物保护研究所的实验室种群。

1.2 正常饲养的斑翅果蝇品系的建立

斑翅果蝇实验室种群饲养于温度为25±0.5℃、相对湿度为70%±0.5%、光周期为16L∶8D的人工气候室中。饲喂以香蕉、苹果、玉米粉、蔗糖、酵母、防腐剂主要成分的人工饲料，此为正常饲养的斑翅果蝇品系。

1.3 无菌斑翅果蝇品系的建立

参考前人的方法(Brummeletal., 2004; 刘威等, 2019)并进行了改进，收集产下后6-8 h内的斑翅果蝇卵，无菌水清洗卵表面后，用3.0%的次氯酸钠消毒1 min, 70%乙醇消毒2次, 1 min/次, 0.1% Triton X-100的磷酸缓冲液(pH 7)清洗1次，用无菌水再次清洗后，将卵转移到灭菌后的果蝇人工饲料上，放置于无菌的塑料培养瓶(直径6 cm，高8 cm)中，于培养箱中培养，温度为25±1℃，相对湿度为60%±2%，光周期为16L∶8D，建立无菌斑翅果蝇体系。

收集无菌斑翅果蝇体系的卵、幼虫研磨，稀释10倍后，取200 μL在NA培养基品平板上涂板，在相同条件的培养箱中培养48 h后，观察无菌落生长便可判断无菌果蝇品系创建成功。

1.4 两种细菌单一感染斑翅果蝇品系的建立

取弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌单菌落在LB培养基中震荡摇菌过夜，将灭菌后的果蝇块状饲料在菌液中浸泡5 min，然后将1.2节无菌果蝇品系与菌液浸泡过的人工饲料放置于无菌的塑料培养瓶(直径6 cm，高8 cm)中，于培养箱中培养，温度、湿度、光周期条件同1.2节，建立两种细菌单一感染果蝇品系。验证方法同1.2节，观察是否只有单一菌种生长，并将菌落进行16S rDNA鉴定，其具体方法如下：

挑取单菌落，在液体培养基中过夜摇匀，以菌液作为模板进行 PCR 扩增。PCR反应体系: DNA 模板 2 μL, 2×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL, 浓度为10 μmol/L上下游引物各 1 μL, 加入ddH2O补充至25 μL。PCR反应程序: 94℃预热3 min; 94℃热变性30 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸1 min, 共 30 个循环; 72℃反应后延伸5 min。引物序列为16S rDNA-27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rDNA-1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后送山东农业科学院测序中心进行双向测序。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST 分析，如确定为弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌，则证明两者的单一感染果蝇品系建立成功。

1.5 斑翅果蝇生长发育指标检测

分别从斑翅果蝇无菌品系、弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌单一感染品系以及正常饲料饲养的品系中挑取斑翅果蝇6-8 h的卵50粒，放置于无菌培养皿中，培养皿底部铺有一层无菌琼脂(3%)，便于保湿和观察。然后放置于培养箱中培养，每2 h观察一次，直至无幼虫孵化为止，重复3次，统计不同斑翅果蝇品系中孵化出的幼虫数量，计算卵孵化率。将上述4种果蝇品系中孵化的幼虫分别转移至相应的培养瓶中，待其化蛹，统计化蛹的数量，计算化蛹率。

另外在上述4种果蝇品系中挑取孵化5 d的3龄幼虫，每10头幼虫为一个重复，称量总重，计算每头幼虫的体重，重复3次。

1.6 3龄幼虫体内主要代谢物含量的测定

在4种斑翅果蝇品系中各挑取大约1.0 g 3龄幼虫，在冰上研磨，根据试剂盒(蛋白质含量测定试剂盒: BCAP-1-W; 氨基酸含量测定试剂盒: AA-1-W; 糖原含量测定试剂盒: TY-1-Y; 游离脂肪酸含量测定试剂盒：FFA-1-W)，加入相应体积的提取液，经过离心、加入反应液、温浴等步骤后用酶标仪(EMax Plus, Molecular Devices)进行测定，波长分别为562, 570, 620和715 nm，每个样品测定 3 次作为技术重复，取其平均值为每个生物学重复的值，根据试剂盒中的公式计算物质含量。每个斑翅果蝇品系设3个生物学重复，分别测定蛋白质、氨基酸、糖原和游离脂肪酸含量。

1.7 3龄幼虫体内抗氧化酶的活力测定

在4种斑翅果蝇品系中各挑取大约1.0 g 3龄幼虫，在冰上研磨，根据试剂盒(SOD含量测定试剂盒: BCAP-1-W; POD含量测定试剂盒: AA-1-W; CAT测定试剂盒:TY-1-Y)，加入相应体积的提取液，经过离心、加入反应液、温浴等步骤后用酶标仪(EMax Plus, Molecular Devices)进行测定，波长分别为560, 470和240 nm，每个样品测定 3 次作为技术重复，取其平均值为每个生物学重复的值，根据试剂盒中的公式计算酶的活力。每个斑翅果蝇品系设3个生物学重复。分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活力。

1.8 数据分析

4种斑翅果蝇品系的卵孵化率、化蛹率、幼虫体重、各代谢物的含量以及抗氧化酶的活力均进行单因素方差分析，采用S-N-K法检验区分平均值，显著水平为0.05。数据分析所用的软件为 SPSS20.0。

2 结果

2.1 两种肠道细菌对斑翅果蝇生长发育的影响

正常饲养条件下，斑翅果蝇的卵孵化率为94.5%±0.9%，显著高于弗氏柠檬酸杆菌感染品系、产酸克雷伯氏菌感染品系和无菌斑翅果蝇品系的(P<0.05)，且无菌品系的卵孵化率最低，但仍有65.9%±3.1%的果蝇卵可以正常孵化(F=30.75,df=2,P<0.01)(图1: A)。

正常饲养斑翅果蝇品系与弗氏柠檬酸杆菌感染斑翅果蝇品系3龄幼虫体重无显著差异(P>0.05)(图1: B)，分别为1.55±0.05和1.49±0.06 mg/头，但显著高于产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系和无菌品系的(P<0.05);与卵孵化率趋势相似，无菌品系的幼虫体重最低，每头仅有0.68±0.04 mg(F=55.08,df=2,P<0.01)。

4种果蝇品系的化蛹率差异显著(F=90.35,df=2,P<0.01)，正常品系的化蛹率为77.5%±2.8%，显著高于其他3个品系的(P<0.05)(图1: C)。

图1 4个斑翅果蝇品系卵孵化率(A)、3龄幼虫体重(B)和化蛹率(C)Fig. 1 Egg hatching rate (A), body weight of the 3rd instar larvae (B) and pupation rate (C) of four Drosophila suzukii strainsSterile: 无菌斑翅果蝇品系Sterile D. suzukii strain; CF: 弗氏柠檬酸杆菌感染的斑翅果蝇品系Citrobacter freundi infected D. suzukii strain; KO: 产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系Klebsiella oxytoca infected D. suzukii strain; Normal: 正常条件饲养的斑翅果蝇品系D. suzukii strains fed in normal conditions. 图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母代表4种果蝇品系间差异显著(P<0.05, One-way ANOVA, S-N-K法)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences among four D. suzukii strains (P<0.05, One-way ANOVA, S-N-K test). 下同The same below．

2.2 两种肠道细菌对斑翅果蝇幼虫蛋白和氨基酸含量的影响

4种品系的3龄幼虫体内蛋白质和氨基酸的含量差异显著(蛋白质:F=16.87,df=2,P<0.01; 氨基酸:F=3.77,df=2,P=0.06)。正常饲养的斑翅果蝇品系3龄幼虫体内蛋白含量(4.04±0.24 mg/g FW)显著高于其他3种果蝇品系的，其次为产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系的(3.47±0.02 mg/g FW)，蛋白质含量较低的为无菌品系和弗氏柠檬酸杆菌感染品系，两者之间差异并不显著(P>0.05)(图2: A)。无菌品系3龄幼虫体内氨基酸含量(236.89±6.22 mg/g FW)与正常品系之间差异不显著(P>0.05)，但显著高于弗氏柠檬酸杆菌感染斑翅果蝇品系(181.54±4.12 mg/g FW)和产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系的(199.18±4.40 mg/g FW)(F=3.77,df=2,P=0.06)(图2: B)。

图2 4个斑翅果蝇品系3龄幼虫体内的蛋白质(A)和氨基酸(B)含量Fig. 2 Contents of protein (A) and amino acids (B) in the 3rd instar larvae of four Drosophila suzukii strains

2.3 两种肠道细菌对斑翅果蝇幼虫糖原和游离脂肪酸含量的影响

由图3可知，不同品系的3龄幼虫体内的糖原和游离脂肪酸含量存在显著差异(糖原:F=15.16,df=2,P<0.01; 游离脂肪酸:F=12.33,df=2,P<0.01)。无菌品系3龄幼虫体内糖原的含量(10.57±0.21 mg/g FW)与正常品系之间并无显著差异(P>0.05)，但添加了细菌后，弗氏柠檬酸杆菌感染的斑翅果蝇品系(8.88±0.51 mg/g FW)和产酸克雷伯氏菌感染的斑翅果蝇品系的糖原含量(8.04±0.29 mg/g FW)显著低于无菌品系和正常品系的(P<0.05)(图3: A)。 弗氏柠檬酸杆菌感染的斑翅果蝇品系3龄幼虫体内游离脂肪酸含量为529.02±7.01 mg/g FW，显著低于无菌品系的(742.51±65.39 mg/g FW)(P<0.05)，但与其他品系间并无显著差异(P>0.05)(图3: B)。

图3 4个斑翅果蝇品系3龄幼虫体内的糖原(A)和游离脂肪酸(B)含量Fig. 3 Contents of glycogen (A) and free fatty acids (B) in the 3rd instar larvae of four Drosophila suzukii strains

2.4 两种肠道细菌对斑翅果蝇幼虫抗氧化酶活性的影响

弗氏柠檬酸杆菌感染品系中3龄幼虫体内的SOD活力(208.65±35.37 U/g FW)显著高于其他3种品系(F=10.54,df=2,P<0.01)，其他品系间并无显著差异(P>0.05)(图4: A)。弗氏柠檬酸杆菌感染品系和产酸克雷伯氏菌感染品系3龄幼虫体内的POD活力显著高于无菌品系和正常饲养品系的(F=2.83,df=2,P<0.01)，但无菌品系与正常饲养的品系之间的差异并不显著(P>0.05)(图4: B)。弗氏柠檬酸杆菌感染品系和产酸克雷伯氏菌感染品系3龄幼虫体内的CAT活力显著低于无菌品系的(F=12.33,df=2,P<0.01)，正常饲养品系的3龄幼虫体内CAT活力显著低于产酸克雷伯氏菌感染品系的(F=10.46,df=2,P<0.01)，但与弗氏柠檬酸杆菌感染品系间并无显著差异(P>0.05)(图4: C)。

图4 4个斑翅果蝇品系3龄幼虫体内的SOD(A), POD(B)和CAT (C)活力Fig. 4 Activities of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in the 3rd instar larvae of four Drosophila suzukii strains

3 结论与讨论

共生菌的消除对寄主昆虫的生长发育会起到消极的作用，表现为体重下降和繁殖力下降(Guoetal., 2017)。本研究中通过卵的表面消毒实现了斑翅果蝇3龄幼虫无菌的目的，表现为卵孵化率降低、体重下降和化蛹率降低，表明其生长发育受到了影响。而弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌的喂回，在一定程度上缓解了生长发育的负面影响，说明这两种菌在斑翅果蝇的生态适应性中具有重要作用。在利用雄性不育技术防治地中海实蝇Ceratitiscapitata和橘小实蝇Bactroceradorsalis的过程中，提高不育昆虫的生态适合度是其中的关键技术，在地中海实蝇的幼虫饲料中添加克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌，可以有效改善地中海实蝇的体长、体重、飞行能力和适合度(Hamdenetal., 2013; Kyritsisetal., 2017)。产酸克雷伯氏菌也可以通过提高橘小实蝇对食物的摄取量、增加糖类和氨基酸的代谢水平来弥补橘小实蝇代谢活力的下降(Caietal., 2018)。

本研究中，与无菌斑翅果蝇品系体内的糖原(图3: A)和氨基酸(图2: B)含量相比，弗氏柠檬酸杆菌或克雷伯氏菌的加入降低了糖原和氨基酸的含量，这可能是由于细菌增殖过程中需要消耗糖类和氨基酸，因此提高了两种物质的代谢水平；本研究中也证明了，与无菌斑翅果蝇品系相比，弗氏柠檬酸杆菌或克雷伯氏菌的加入提高了斑翅果蝇体内蛋白质的水平(图2: A)，这是因为氨基酸代谢水平上升会导致蛋白质含量提高，显然，这些生理变化可补充斑翅果蝇体内蛋白质的缺乏。这与前人的研究结果相一致。另外，与无菌品系相比，单一弗氏柠檬酸杆菌感染的品系体内的游离脂肪酸含量也明显降低(图3: B)，这可能是由于弗氏柠檬酸杆菌将斑翅果蝇肠道内的糖原分解后更多地用于自身的增殖和斑翅果蝇的营养需要，合成的脂肪含量降低，使斑翅果蝇脂类的代谢受到了抑制，从而游离脂肪酸含量下降，但其具体的代谢过程仍需要多种代谢物和相关酶类的检测来进行验证。

消除掉共生菌以及单一共生菌感染后，斑翅果蝇自身会产生应激反应。本研究通过测定4种斑翅果蝇品系体内抗氧化酶活性的变化，发现与正常饲养的果蝇品系相比，弗氏柠檬酸杆菌的添加使3龄幼虫体内SOD活力显著提高(图4: A)，而弗氏柠檬酸杆菌和产酸克雷伯氏菌的存在对POD的活力也有促进作用(图4: B)，但对CAT活力有抑制作用(图4: C)，因此两种菌对斑翅果蝇抗氧化酶的活力均有不同程度的影响，对有机体具有保护作用。多项研究表明，弗氏柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌是昆虫的有益菌，可提高昆虫抵御外界不良环境的能力(Hussenederetal., 2017)。葱地种蝇D.antigua幼虫肠道中的弗氏柠檬酸杆菌和增强性沙雷菌Serratiaplymuthica等细菌可以抑制白僵菌菌丝和孢子的生长，增加葱地种蝇对白僵菌的抗性(Zhouetal., 2019)。橘小实蝇体内的弗氏柠檬酸杆菌在敌百虫等有机磷杀虫剂的降解过程中起关键作用，经抗生素处理的桔小实蝇对敌百虫的抗性明显降低(Chengetal., 2017)，这可能是桔小实蝇对有机磷杀虫剂产生抗药性的原因之一。

除此之外，这两种菌还可促进寄主昆虫的交配行为。例如，桔小实蝇雌虫肠道中的产酸克雷伯氏菌可以吸引雄虫进行交配(Wangetal., 2014; Damodarametal., 2016)；瓜实蝇B.cucurbitae中肠中的克雷伯氏菌和柠檬酸杆菌其培养上清液中含有大量的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、异氰酸丁酯、2-甲基-1-丙醇和3-羟基-2-丁烷，可吸引瓜实蝇雌虫完成交配行为(Hadapadetal., 2016)。因此，共生细菌对寄主昆虫具有一定的引诱潜力，可为生态友好型昆虫防治提供参考。本研究发现弗氏柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌对斑翅果蝇的生长发育和代谢过程均有影响，但对其机制及生态适应性意义还需要进一步的研究。