绿豆象幼虫虫龄的划分及末龄幼虫头部形态和感器观察

崔小林, 王宏民, 张 静, 张仙红, 郑海霞,*

(1. 山西农业大学农学院, 山西太谷 030801; 2. 山西农业大学经济管理学院, 山西太谷 030801)

绿豆象Callosobruchuschinensis属鞘翅目(Coleoptera)豆象科(Bruchidae)瘤背豆象属Callosobruchus，是重要的仓储害虫之一，主要以幼虫蛀食绿豆Vignaradiata、豌豆Pisumsativum、扁豆Lablabpurpureus等植物的种子(Cuietal., 2019)。绿豆象分布广泛，在我国大部分地区均有发生。由于该虫隐蔽性强，可重复为害其他豆粒，对豆科作物的产量与品质造成了严重的威胁。其中对绿豆的为害最为严重，仓内绿豆的蛀蚀率可以高达69%(成小芳等, 2017)。目前对绿豆象的研究主要包括绿豆象的防治方法(徐长明, 1992; 杨长举等, 1994; 陈新等, 2014)，绿豆象抗性基因的标记及其衰老的分子机制(Tanaka, 1993; Chenetal., 2007)，绿豆象成虫触角感器扫描电镜观察(杨萌萌, 2016)，豆类品种以及温度等对绿豆象生长发育的影响(王燕等, 2010; 成小芳等, 2017; 王宏民等, 2017b)，绿豆豆荚挥发性物质对绿豆象产卵选择性的影响(王宏民等, 2017a)，以及绿豆象触角转录组测序及嗅觉相关基因的分析(郑海霞等, 2018)等。绿豆象幼虫主要钻蛀豆粒，因此对其生物学、生态学及防治等方面的研究难度较大。

幼虫准确分龄是开展生物学及防控研究的基础(Esperketal., 2007; Chenetal., 2013)。对于具有钻蛀性的昆虫，无法通过直接观察蜕皮情况划分虫龄。依据戴氏法则，幼虫某一部位的长、宽度随着龄期增长呈一定的几何级数量关系(Dyar, 1890)。很多学者对钻蛀性昆虫的幼虫虫龄进行了研究(王小艺等, 2005; 张海滨等, 2011; 李志文等, 2015; 张燕如等, 2018)，目前，对于绿豆象的分龄指标还未见相关报道。

昆虫的头部是取食和感觉中心，其上分布有许多化学感受器，昆虫依靠这些化学感受器对外界的化学刺激和机械作用进行感知，从而完成取食、求偶、交配、产卵及躲避天敌等一系列活动(van Loon, 1996)。研究表明，不同种类的昆虫化学感受器类型、数量及分布差异很大(Städleretal., 1995)。许多学者对幼虫头部感器进行了研究(张蒙等, 2014; 周平等, 2015; 孟海林等, 2017; 张方梅等, 2019)，但关于绿豆象幼虫感器仍未见相关报道。

本研究以绿豆象幼虫为研究对象，选择其体长、头壳宽及上颚宽作为指标进行测定，划分幼虫虫龄，同时利用扫描电镜对末龄幼虫的头部形态进行观察，旨在找出判定绿豆象幼虫龄数的最佳形态指标，准确地预测其发生时间，了解其发生规律，以便及时采取有效的防治策略，为研究其生物学、行为学及综合防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

本实验所选试虫为山西农业大学农学院昆虫实验室室内长期饲养(饲养条件：温度26±1℃，相对湿度75%～80%，光周期16L∶8D)的绿豆象。

1.2 幼虫样本收集

在饲养条件下，将新羽化的绿豆象放入装有新鲜绿豆的培养皿中培养并观察产卵情况，待卵孵化后，每天取出15粒绿豆，剖开绿豆，取出幼虫，直到所取幼虫化蛹，累计取27 d。用75%酒精杀死幼虫，将虫体平展并及时测量(测量过程中损坏的幼虫不计入测量总数内)。

1.3 幼虫分龄指标及测量方法

参考李志文等(2015)、杨美红等(2012)和周平等(2015)选取绿豆象幼虫的体长、头壳宽及上颚宽作为其形态分龄指标。测量时用Nikon SMZ745T体视镜，测量指标如图1所示，及时记录幼虫体长、头壳宽及上颚宽。同时对体长与头壳宽比值进行了分析，每个龄期的幼虫随机选5头样本，取各个指标的平均值，再用平均值计算体长与头壳宽之比，进行3组重复。

图1 绿豆象幼虫各测量指标Fig. 1 Measurements of Callosobruchus chinensis larvaeA: 幼虫头部Larval head; B: 幼虫Larva. a: 体长Body length; b: 头壳宽Head capsule width; c: 上颚宽Mandible width.

1.4 幼虫头部形态与感器扫描电镜观察

将选取的健康的绿豆象末龄幼虫放入经过4℃预冷的2.5%戊二醛中4℃固定24～48 h；将固定好的幼虫取出，用新配制的磷酸缓冲液在超声波震荡仪中反复清洗，以去除其表面杂质，便于后期的观察；然后分别用70%, 80%, 85%, 90%, 95%和100%的乙醇溶液对样品进行梯度脱水，每次脱水15 min，每种浓度进行3次，在每次脱水后用超声波清洗15 s(在乙醇溶液浓度为90%, 95%和100%时不进行此项操作)；将脱水过后的绿豆象幼虫用干燥器进行烘干，将烘干后的头部样品用双面导电胶依次固定在样品台上；随后将样品放置在日立E-1010离子溅射仪中进行离子溅射喷金镀膜；最后使用S-4800扫描电镜(Hitachi Ltd., Tokyo, 日本)对其进行观察拍照。观察个体数4头。

1.5 感器鉴定与命名

感器鉴定与命名参照Zacharuk和Shields (1991)的方法，同时参考近年来国内外学者对于鞘翅目幼虫触角及口器超微结构的研究结果(Alekseevetal., 2006; Eilersetal., 2012)。

1.6 数据分析

将所测得的数据运用Excel 2010进行预处理，利用IBM SPSS24.0进行统计分析，用Origin9.1将幼虫体长、头壳宽和上颚宽值由小到大制作成频次分布直方图，据此初步划分虫龄。根据测量值分别计算绿豆象各龄幼虫3项分龄指标的变幅、平均值、标准误和变异系数，同时对体长与头壳宽的比值进行单因素方差分析，用Duncan氏新复极差法检验差异性。根据Crosby生长法则计算Brooks指数和Crosby指数，对已获得的3项指标测量数据与相应的龄数进行回归分析，比较各指标分龄的合理性，进而选择最佳分龄指标。利用ImageJ软件测量各类感受器的长度。

Brooks指数=Xn/Xn-1，其中Xn和Xn-1分别表示第n龄和n-1龄幼虫各个测量指标的平均值；Crosby指数=(bn-bn-1)/bn-1，其中bn和bn-1分别表示第n和n-1个的Brooks指数；变异系数C.V(%)=标准差/均值×100%。

2 结果

2.1绿豆象幼虫的分龄

根据对所选绿豆象幼虫的体长、头壳宽及上颚宽的测量值进行频次分布分析，以一个频次分布集中区域代表幼虫的一个龄期。绿豆象的这3项形态指标均具有4个明显的峰值(图2)，据此推断绿豆象幼虫为4个虫龄。结果提示幼虫体长、头壳宽及上颚宽适合作为绿豆象的幼虫分龄指标。

2.2 绿豆象幼虫最佳分龄指标

绿豆象幼虫体长、头壳宽和上颚宽3项分龄指标的各峰之间并无间断，相邻龄期之间存在交叉重叠现象(表1)。根据测量值分别计算绿豆象各龄幼虫这3项分龄指标的变幅、平均值、标准误、变异系数、Brooks指数和Crosby指数，结果如表1所示。绿豆象幼虫各项分龄指标的变异系数均偏低，且Crosby指数均小于10%，表明将绿豆象幼虫划分为4个虫龄是合理的。且头壳宽的Crosby指数均小于体长和上颚宽的Crosby指数，所以可将头壳宽作为最佳分龄指标。

2.3 绿豆象体长与头壳宽比值分析

通过计算不同龄期幼虫的体长与头壳宽的比值(图3)可以看出：随着绿豆象幼虫虫龄的增加，各龄幼虫的体长与头壳宽的比值不同，1, 2, 3和4龄幼虫体长与头壳宽比值分别为3.44, 3.41, 3.54和3.45。方差分析表明，1, 2与4龄幼虫的体长与头壳宽比值差异不显著(P>0.05)，但显著低于3龄幼虫(P<0.05)。结果说明体长与头壳宽比值不适合作为分龄指标。

2.4 绿豆象幼虫龄数的确定及拟合效果

对3项分龄指标和龄期进行线性关系和指数关系分析，并进行曲线拟合，结果表明，绿豆象幼虫的3项分龄指标的线性关系和指数关系与龄期存在极显著的相关关系(表2)；其中3项分龄指标与龄期之间的三次线性拟合模型的回归系数最大，二次线性拟合模型的回归系数次之，直线拟合模型的回归系数再次之，指数拟合模型的回归系数相比最低；同时，幼虫头壳宽与体长测量值的对数值与幼虫龄期的相关系数要优于上颚宽测量值的对数值与幼虫龄期的相关系数，结合表1的分析结果，可将头壳宽作为划分绿豆象幼虫龄期的最佳指标。幼虫体长和上颚宽可作为辅助指标，进行验证。

图2 绿豆象幼虫体长(A)、头壳宽(B)和上颚宽(C)频次分布直方图Fig. 2 Frequency histograms of body length (A), head capsule width (B) and mandible width (C) ofCallosobruchus chinensis larvae

表1 绿豆象幼虫3项分龄指标测量值及统计分析Table 1 Measurements and statistics for three indexes of instar division of Callosobruchus chinensis larvae

表中同一指标均值±标准误后不同字母表示不同龄期间同一指标经LSD多重比较检验在0.05水平上差异显著。Different letters following means±SEwithin the same variable show significant differences in the same morphological variable between larval instars based on Fisher’s LSD test at the 5% level.

图3 绿豆象幼虫体长与头壳宽的比值Fig. 3 The ratio of body length to head capsule widthof Callosobruchus chinensis larvae1: 1龄幼虫1st instar larva; 2: 2龄幼虫2nd instar larva; 3: 3龄幼虫3rd instar larva; 4: 4龄幼虫4th instar larva. 图中数据为平均值±标准误，柱上小写字母表示不同龄期间差异显著(P<0.05, Duncan氏检验)。Data in the figure are mean±SE. Different small letters above bars indicate significant difference among different larval instars (P<0.05, Duncan’s test).

对绿豆象幼虫分龄指标和龄数进行曲线拟合，结果显示，二次模型和三次模型(R>0.950,P<0.001)对3项分龄指标拟合效果最好(图4)，复合函数、增长函数和指数函数(R>0.930,P<0.001)的拟合效果较好，可进一步验证绿豆象幼虫分为4龄是正确的。

2.5 绿豆象末龄幼虫头部形态

绿豆象末龄幼虫头部左右对称，呈圆台状，头壳上分布有一些毛形感器；口器为咀嚼式口器，由上唇、上颚、下颚、下唇、下颚须和下唇须组成；触角为单节，形状粗短，位于头部前外侧，着生于口器旁边，基部在触角窝内；有一对单眼位于触角侧下方(图5: A, B, C)。

2.6 绿豆象幼虫头部感器

绿豆象幼虫头部共有7种感器，分别是锥形感器、毛形感器、刺形感器、瓶形感器、坛形感器、栓锥形感器及板形感器，主要分布于触角、下颚须、上唇和上颚。

2.6.1幼虫触角感器：绿豆象末龄幼虫触角末梢着生有Ⅰ型锥形感器、Ⅰ型毛形感器和刺形感器，侧面有刺形感器，靠近触角窝有一个瓶形感器(图5: D)。Ⅰ型锥形感器椎体扁宽短小，基部粗壮，顶端较钝；Ⅰ型毛形感器端部径直前伸，自然弯曲；刺形感器倾斜或者直立于触角表面，末端尖锐；瓶形感器呈葫芦状，在触角表面形成一个凸起。

2.6.2幼虫下颚须感器：幼虫下颚须外侧面有1个板形感器，着生于细长穴中，周围有宽边，为拉长细直形；下颚须基部有1个栓锥形感器，其底座为一圆形腔；在板形感器前方有1个坛形感器，呈圆环状，中间有一微小凸起(图5: E)。下颚须末梢有Ⅰ型锥形感器和Ⅱ型锥形感器共13个，Ⅱ型锥形感器呈圆柱状，从基部到顶端直径为明显变化。

表2 绿豆象幼虫3种形态结构测量值回归方程及回归系数Table 2 Regression equation and coefficient of three morphological variables of Callosobruchus chinensis

图4 绿豆象幼虫体长(A)、头壳宽(B)、上颚宽(C)与龄数之间的关系拟合结果Fig. 4 Regression relationship between number of larval instars and body length (A), head capsule width (B)or mandible width (C) of Callosobruchus chinensis larvae1: 1龄幼虫1st instar larva; 2: 2龄幼虫2nd instar larva; 3: 3龄幼虫3rd instar larva; 4: 4龄幼虫4th instar larva.

图5 绿豆象末龄幼虫头部的扫描电镜图Fig. 5 Scanning electron microscope photographs of the head of the final instar larva of Callosobruchus chinensisA: 头部腹面图Head in ventral view; B: 头部正面图Head in front view; C: 头部侧面图Head in lateral view; D: 触角Antenna; E: 下颚须Maxillary palpus; F: 上唇末端毛形感器Sensillum trichodeum on the terminal end of labrum. Anf: 触角窝Antennal fossa; Ant: 触角Antenna; Cly: 唇基Clypeus; Lai: 下唇Labium; Lar: 上唇Labrum; Md: 上颚Mandible; Mp: 下颚须Maxillary palpus; Oce: 单眼Ocellus; SA: 坛形感器Sensillum ampullaceum; SB: 锥形感器Sensillum basiconicum; SC: 刺形感器 Sensillum chaeticum; SL: 瓶形感器Sensillum lageniform; SP: 板形感器Sensillum placodeum; SS: 栓锥形感器Sensillum styloconicum; ST: 毛形感器Sensillum trichodeum.

2.6.3上唇及上颚感器：幼虫的唇基有轻微骨化，横向延长，在唇基两侧各有一个Ⅱ型毛形感器，其端部呈弯钩状，中间有一个坛形感器，上唇部分呈倒三角形，末端布满毛形感器(图5: F)。幼虫上颚严重骨化，上面有锥状咀嚼表面，每个咀嚼面上都有Ⅱ型毛形感器。

3 讨论

绿豆象为钻蛀性害虫，生活方式隐蔽，对其幼虫龄数准确判定较难。本研究通过测定绿豆象幼虫的体长、头壳宽和上颚宽值，并对所测数据进行统计分析，确定了绿豆象幼虫分为4龄。这与陆惠生(1990)在南宁室内常温条件下观察到的绿豆象幼虫为4龄的结果一致，但不同于黄建国(1980)在郑州室内常温观察结果5龄，造成这样的结果可能与地区、样本数及当时幼虫的生长环境有关。同时这些研究也说明绿豆象作为一种重要的仓储害虫，其生长发育的主要影响因素是温度。幼虫的体长、头壳宽和上颚宽可能受环境影响有所差异，如温度、湿度和营养条件等，可将体长与头壳宽的比值作为辅助参考进行分龄。张润志等(1999)鉴别麦双尾蚜Diuraphisnoxia的龄期时，认为绝对长度受营养等环境条件的影响而有差异，从而通过计算一些定性特征长度的比值来鉴别龄期；杨萍(2005)等认为枯叶蛱蝶Killimainachis的体长与头壳宽的比值可用来衡量幼虫生长状况的好坏，比值大且随着幼虫生长增长加快的个体生长良好，反之幼虫个体生长状况较差。

表3 绿豆象末龄幼虫头部感受器的分布、类型及长度Table 3 The distribution, type and length of sensilla on the headof the final instar larvae of Callosobruchus chinensis

表中数据为平均值±SE(n=4). Data in the table are mean±SE(n=4).

昆虫幼虫虫体的生长具有一定规律性，大多数昆虫幼虫的体长是连续增长的，而身体骨化程度较高的部分伴随周期性蜕皮而呈跳跃式增长(Loerch and Cameron, 1983)，因此骨化部位常用来作为幼虫分龄的指标(Daly, 1985)，尤其是头壳宽，在许多钻蛀性昆虫的分龄研究中作为最佳分龄指标(Panzavolta, 2007)。鳞翅目中如杨美红等(2012)在测定榆木蠹蛾Holcocerusvicarius幼虫龄数时，测量了其头壳宽、体长、体宽、前胸背板宽、上颚长和上颚宽，确定头壳宽为最佳分龄指标；李召波等(2014)通过测定二点委夜蛾Athetislepigone幼虫头壳宽、体长和体重，发现头壳宽可作为该幼虫的分龄指标，体长和体重则不合适；周斌等(2015)在测定降香黄檀食叶害虫棕斑澳黄毒蛾Orvascasubnotata的幼虫虫龄时，测定了其头宽、前胸毛瘤宽和体长，确定了头宽为其最佳分龄指标。鞘翅目中如李志文等(2015)对油茶象Curculiochinensis幼虫虫龄的划分进行研究时，发现其头壳宽、头壳长和上颚宽可作为虫龄分龄指标，且头壳宽为最佳分龄指标；赵莉等(2001)通过测定蓼龟象甲Rhinoncuspericarpius幼虫的头壳宽来划分其幼虫虫龄。本研究结果也表明，头壳宽是绿豆象幼虫的最佳分龄指标。

陈永年和潘桐(1988)认为昆虫幼虫及其他表皮结构的增长与幼虫虫龄之间有两种关系，一种是其对数值与虫龄呈直线关系，另一种是其对数值与虫龄呈修改指数曲线关系；邓侨等(2015)在骆驼斯氏副柔线虫病传播媒介西方角蝇Haematobiairritans和截脉角蝇H.titillans的幼虫龄期划分中也验证了两种角蝇幼虫的骨化结构测量值的对数值与幼虫龄期数存在着极显著的相关性。绿豆象幼虫各项指标的模型拟合中，复合模型、增长模型和指数模型的拟合性都比较好，这与已有相关报道一致。

昆虫幼虫体表感器依据其形态可分为毛形感器、刺形感器和锥形感器等多种类型；依据其功能可分为温度-湿度感受器、化学感受器、机械感受器等。绿豆象末龄幼虫头部感器主要分布在触角、下颚须、上唇和上颚，类型有锥形感器、毛形感器、刺形感器、瓶形感器、板形感器、栓锥形感器及坛形感器共7种。这些感器在一些昆虫的幼虫触角及口器部分中已有发现，但形态不尽相同，孟海林等(2017)发现筛胸梳爪扣甲Melamotuscribricollis的触角分布有刺形感器、锥形感器、钩形感器和圆盘形感器，下颚须上分布有锥形感器、腔锥形感器和坛形感器，下唇须上分布有锥形感器、腔锥形感器、坛形感器、毛形感器、乳突形感器、凹槽形感器和哑铃形感器；徐丽丽(2016)发现沟胫天牛亚科(Lamiinae)7种天牛(光肩星天牛Anoplophoraglabripennis、星天牛A.chinensis、松墨天牛Monochamusalternatus、蓝墨天牛M.guerryi、桑天牛Aprionarugicollis、锈色粒肩天牛A.swainsoni和云斑白条天牛Batoceralineolata)幼虫触角感器有末梢锥状感器、锥形感器及深窝感器，下颚须和下唇须上观察到末梢锥状感器、板形感器及刺形感器；李霜(2017)研究发现连草直胸跳甲Agasicleshygrophila幼虫触角的感器有腔锥形感器、锥形感器、栓锥形感器和Böhm氏鬃毛，下颚须主要有锥形感器和花瓣形感器，下唇须主要有指形感器和锥形感器。

本研究所用绿豆象幼虫均为室内恒定条件人工饲养获得，所以幼虫龄期可能与自然条件下龄期存在一定的差异，昆虫的生长发育受多种因素的影响，如温度、湿度、食物、种群等，这些因素对绿豆象幼虫虫龄的划分是否产生影响，本研究方法是否适用于所有环境条件下的绿豆象幼虫龄期的鉴别还有待于进一步研究；绿豆象幼虫头部感器种类较丰富，这些感受器的具体功能及在取食危害过程中的作用等，还需更多电生理学及解剖学实验的结果作为证据。