环杷明抑制肝星形细胞激活改善肝纤维化作用实验研究*

刘翔宇，王凌云

山东省济宁市第一人民医院消化内科(济宁 272000)

肝纤维化是肝脏对反复发生的慢性肝损伤的治愈过程，包括病毒感染、胆汁淤积性肝病、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝以及一些药物的副作用[1-3]。其特点是细胞外基质(ECM)过度沉积，形成纤维性瘢痕，引起肝功能障碍，可能发展为肝硬化和肝癌。幸运的是，如果去除主要的致病因素，肝纤维化是一个可逆的过程，但这总是困难和费时的。目前治疗肝纤维化最有效的方法是肝移植。然而，由于器官供体的限制，肝移植并不普及。因此，有必要寻找一种新的治疗肝纤维化的药物，以减轻肝功能障碍和减少并发症[4-5]。

对肝纤维化的发病机制研究发现，肝星状细胞(Hepatic stellate cell， HSCs)的活化是其发病的关键。在健康的肝脏中，HSCs定位于Disse空间，具有静止表型(qHSCs)[4]；当肝脏损伤刺激后，Kupffer细胞和其他间充质细胞被激活并分泌多种促纤维化细胞因子，包括转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)和表皮生长因子(EGF)，导致肝星状细胞的激活。激活的HSCs (aHSCs)经过一系列的活化反应，导致ECM过度积聚和肝纤维化[6]。除ECM沉积外，肝损伤与血管生成有关。此外，由于组织缺氧，血管生成和纤维生成总是与慢性肝病并行发展。病理性血管生成加剧了结构紊乱，而不是缓解。据报道，酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼或索拉非尼抑制血管生成，可改善啮齿类动物的肝纤维化。因此，血管生成也是治疗肝纤维化的重要靶点[7]。

环杷明是一种从藜芦属植物中提取的甾体生物碱，在大量的临床前研究中显示出了良好的抗癌作用。它是Hedgehog (HH)信号通路的抑制剂。HH信号通路的异常激活导致了多种人类疾病的发生，如结直肠癌、肺癌和乳腺癌[8]。临床上我们发现环杷明对肝纤维化具有调控作用，但具体调控作用机制不清楚。因此本研究的目的在于阐明环杷明对肝纤维化的调控作用机制。

材料和方法

1 材 料 戊巴比妥钠盐、环杷明、磷酸盐缓冲液(PBS)、维生素D3、白藜芦醇、姜黄素购买于Sigma-Aldrich (Merck KGaA)。无水乙醇、二甲苯、Masson染液套装、分化液、HE染液、 中性树胶、CCl4购于中国国药控股国际公司。GAPDH、α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1、ALT试剂盒和AST试剂盒购于SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY。

2 研究方法

2.1 肝纤维化小鼠模型构建和药物干预：准备20% CCl4的油剂溶液(CCl4∶橄榄油=1∶4)，3 d一次对小鼠进行皮下注射，注射量按5 ml/kg进行，连续4周；对照组注射同等剂量橄榄油溶剂。

第4周开始，对模型组分别进行环杷明5或10 mg/(kg·d)皮下注射、维生素D33 ng/(100g·d)皮下注射、白藜芦醇200 mg/(kg·d)灌胃、姜黄素 400 mg/(kg·d)灌胃。第8周，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，眼眶取血后常温放置30 min，1800 r/min离心5 min取上清，冷冻-80℃保存；取肝组织分别进行4%多聚甲醛固定和-80℃冷冻保存。

2.2 生化指标检测:小鼠血清ALT和AST检测按照说明书进行操作。

2.3 免疫组化检测:对固定的肝脏组织进行切片和石蜡包埋，并切成4 μm厚的切片，进行CD31、α-SMA和Masson染色。显微镜镜检，图像采集分析。

2.4 Western blotting:提取总蛋白，标定后进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，然后进行VEGF、CD31、α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1染色，对结果进行拍照、收集、分析。GAPDH为内参蛋白。

3 统计学方法 连续变量用均数±标准差表示。使用Graph Pad Prism软件5.0版(Graph Pad,La Jolla,CA,USA)对多组比较进行单向方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 环杷明可显著抑制CCl4诱导的肝损伤和纤维化 对导致肝损伤的血清标记蛋白ALT和AST进行检测发现，相对对照组，CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型血清中ALT和AST表达上调，环杷明、维生素D3、白藜芦醇、姜黄素等治疗后均可抑制ALT和AST表达(P<0.001)，其中环杷明治疗效果最好，且环杷明10 mg/kg浓度治疗效果好于5 mg/kg。提示环杷明治疗可显著降低CCl4诱导的小鼠肝损伤，如图1A和1B所示。对肝组织进行Masson染色发现，CCl4诱导下显著促进了胶原蛋白沉积，环杷明、维生素D3、白藜芦醇、姜黄素等治疗后均可抑制胶原蛋白沉积，其中环杷明治疗效果最好，且环杷明10 mg/kg浓度治疗效果好于5 mg/kg。提示环杷明治疗可显著降低CCl4诱导的小鼠肝纤维化。如图1C所示。

2 环杷明可显著抑制肝星状细胞激活和肝血管生成 对肝组织中血管形成标记蛋白CD31进行检测发现，相对对照组，CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型肝组织中CD31表达上调，环杷明治疗后可显著抑制肝组织中CD31表达，且环杷明10 mg/kg浓度治疗效果好于5 mg/kg (P<0.001)。如图2A和2B所示。对导致肝损纤维化的肝星状细胞激活标记蛋白α-SMA进行检测发现，相对对照组，CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型肝组织中α-SMA表达上调，环杷明治疗后可显著抑制肝组织中α-SMA表达，且环杷明10 mg/kg浓度治疗效果好于5 mg/kg。如图2A和2C所示(P<0.001)。提示环杷明治疗可显著降低CCl4诱导的小鼠肝组织中血管生成和肝星状细胞激活。

图1 ELISA检测血清中ALT(A)、AST(B) 表达及肝组织纤维化(C)

图2 免疫组化检测肝组织中CD31、α-SMA表达(A)及对CD31(B)、α-SMA(C)相对表达量的统计学分析

3 环杷明可显著抑制血管形成和纤维化相关蛋白表达 见图3。相对对照组，CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型肝组织VEGF表达上调，环杷明可显著抑制肝组织VEGF表达，且环杷明10 mg/kg疗效好于5 mg/kg。对α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1检测发现，相对对照组，CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型肝组织中α-SMA、Collagen Ⅰ和TGF-β1表达上调，环杷明治疗可显著抑制肝组织中α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1表达，且环杷明10 mg/kg疗效好于5 mg/kg。提示环杷明治疗可显著降低CCl4诱导的小鼠肝组织中血管生成和纤维化。

图3 Western blot检测肝组织中VEGF、α-SMA、CollagenⅠ和TGF-β1表达

讨 论

肝纤维化是一个世界性的严重健康问题，因为肝纤维化是一切慢性肝病的基础，最终会发展为肝硬化，甚至是肝癌[9]。目前常见的纤维化方法有免疫抑制剂、抗炎因子、PPARγ受体激动剂等[10]。在肝纤维化的发生发展和逆转过程中，肝星状细胞活化，成为肌成纤维细胞活化和增殖的最大贡献者[11]。在正常肝脏中，肝星状细胞维持ECM的产生和降解，维持ECM沉积的平衡，然而，在肝纤维化中，静止状态下的肝星状细胞过度激活成激活状态的肝星状细胞，导致了ECM的过度沉积，特别是胶原蛋白[12]。

HH信号通路由三种HH 配体即Sonic hedgehog(Shh)、India hedgehog(Ihh)和 Desert hedgehog(Dhh)，两个跨膜受体蛋白Patched (Ptch)1 和Smoothened (Smo)，以及三个核转录因子Gli1、Gli2和 Gli3组成[13]。有实验表明，在HSC活化过程中HH信号通路被激活，而抑制HH信号的活性可导致HSC的增殖被抑制且分化过程被部分阻止[14]。同时活化的Gli还能通过激活PDGF、TGFβ/Smad等信号通路，促进HSC的活化[14]。目前发现环杷明可抑制HH信号通路中的 Smo蛋白[13]；姜黄素能阻断HH、ERK信号通路[15]；白藜芦醇可抑制HH信号通路成员Gli1、Ptch和 cyclin D1mRNA的表达[16]，维生素D亦有抑制Hh信号通路致GLi1表达下调的作用[17]。

本课题研究发现，环杷明、维生素D3、白藜芦醇和姜黄素均可有效降低CCl4诱导的小鼠的转氨酶水平(AST、ALT)，同时抑制肝组织纤维化。证实环杷明抑制了VEGF介导的血管生成，同时环杷明可抑制TGF-β1等诱导的肝星状细胞活化和ECM沉积，从而逆转肝纤维化的进展。有研究表明，环杷明的抗纤维化作用与其抑制HH信号通路有关，白藜芦醇、姜黄素、维生素D3亦有抑制HH信号通路的作用。我们研究发现，环杷明的抗纤维化作用与剂量成正相关，高剂量的白藜芦醇、姜黄素、维生素D3是否能提高抗纤维化的作用及在人体内的合适剂量仍需进一步研究。