miR-20a-5p 调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证

李亚冲，刘颖，朱恩东

（1.天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津300070；2.天津医科大学朱宪彝纪念医院生化与分子生物学研究室，国家卫生健康委员会激素与发育重点实验室,天津市代谢性疾病重点实验室，天津市内分泌研究所，天津300134）

microRNA 是一类长度为18～25 个核苷酸的小的非编码内源性RNA 分子，可以通过与靶基因mRNA 3′非翻译区（3′UTR）发生完全或不完全互补配对，致使mRNA 降解或翻译被抑制，从而在转录水平或转录后水平调控基因的表达[1]。近期研究发现，miR-20a-5p 在组织和器官发育中发挥重要作用[2]。例如，miR-20a-5p 可延长细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化，同时上调血管生成基因（如成纤维细胞生长因子9）的表达[3]，并且miR-20a-5p可以通过抑制组蛋白去甲基化酶Kdm6b 及转录因子Kruppel 样因子3（Klf3）等靶基因的表达，促进间充质干细胞的成脂分化[4-5]。Zhang 等[6]研究发现，miR-20a-5p 可通过靶向抑制过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）的表达促进人间充质干细胞的成骨分化。此外，本课题组的前期研究初步证实了miR-20a-5p 具有促进小鼠间充质干细胞向成骨细胞分化的功能[4]。然而，笔者检测发现小鼠PPARγ mRNA 3′UTR 区并不存在 miR-20a-5p 的结合位点，而且miR-20a-5p 不能抑制小鼠PPARγ 基因蛋白水平的表达，因此miR-20a-5p 在成骨分化过程中的靶向分子机制尚需进一步研究。深入了解microRNA 调控成骨分化的分子机制将有助于完善对骨代谢相关疾病的认识。本研究旨在筛选miR-20a-5p在成骨分化中的靶向作用基因，进一步验证其靶向关系，阐明miR-20a-5p 调控成骨分化的分子机制，为临床利用microRNA 调控成骨细胞分化的生物学行为奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 高效率逆转录试剂盒购买自美国Ther mo Fisher 公司；SE 无缝克隆和组装试剂盒购买自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；Mut Express®II Fast Mutagenesis Kit 购买自南京诺唯赞生物科技有限公司；DMEM 高糖（DMEM/H）培养基购买自上海源培生物科技有限公司；Trizol 和LipofectamineTM2000 购买自美国 Invitrogen 公司；miR-20a-5p miR-NC 及miR-mimics 由上海吉玛制药技术有限公司合成；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购买自美国Promega 公司；全自动酶标仪购买自美国伯腾仪器有限公司；流式细胞仪购买自美国BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HEK-293T 和MC3T3-E1 均用含有10% FBS 的DMEM/H 培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 cDNA 的获取 收集 MC3T3-E1 细胞，用Trizol 法提取总 RNA。取 0.5 μg 总 RNA 逆转录为cDNA。逆转录的条件：25℃ 10 min；42℃ 60 min；70℃ 10 min。

1.2.3 靶基因的预测 通过靶基因预测数据库TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org/mmu_72/）预测miR-20a-5p 的靶基因，选定Smad7 作为miR-20a-5p 的候选靶基因。

1.2.4 miR-20a-5p 靶基因荧光报告载体的构建 根据靶基因预测数据库TargetScan 中查找的靶基因3′UTR 序列，设计Smad7 上下游特异性同源引物，上游引物：5′-TGA TGA AAG CTG CGC AAT CCC TTG GCT GGC TCC-3′，下游引物：5′-AAA AGA TCC TTT ATT AGC TAG GTG ATA ACA CCC ATA GAA-3′。

以上面逆转录合成的cDNA 为模板，用Smad7上下游特异性引物扩增Smad7 的3′UTR 序列。将pMIR-REPORT-Luciferase 载体进行 Spe I、HindⅢ双酶切。利用SE 无缝克隆体系将Smad7 扩增产物和pMIR-REPORT-Luciferase 载体酶切产物于37℃进行重组反应30 min，取重组产物转化DH5α 感受态细胞，均匀涂布在含有氨苄抗性的固体LB 平板上，倒置于37℃孵箱过夜培养。于平板中挑取单菌落送交测序，测序正确的样品进一步提取重组质粒，命名为pMIR-LUC-Smad7，置于-80℃储存备用。

设计Smad7 点突变上下游引物，上游引物：5′-AAG ATC CTC ATA GCT TTA ATA TAA ATG CAA ATA ACA TGC CAA AT-3′，下游引物：5′-AAA GCT ATG AGG ATC TTT TCT TTA TTC TTC TCG TTT ATA CAC ATT G-3′。以 pMIR-LUC-Smad7 为模板，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 进行载体扩增，扩增产物使用DpnI 于37℃消化1 h 去除甲基化模板质粒；然后用Exnase Ⅱ使扩增产物同源重组。挑选测序结果正确样品提取质粒，命名为 pMIR-LUC-Smad7-MUT，置于-80℃保存备用。

1.2.5 miR-20a-5p 靶基因绿色荧光（GFP）报告载体的构建 设计扩增eGFP 的上下游特异性引物，上游引物：5′-CGG GAT CCA CCA TGG TGA GCA AGG GCG AGG -3′，下游引物：5′-CCG CTC GAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3′。以质粒pMIR-REPORT-eGFP 为模板进行PCR 扩增，将扩增产物 pMIR-LUC-Smad7 和 pMIR-LUC-Smad7-MUT 分别使用Bam H I 和 Xho I 进行双酶切。利用T4 DNA 连接酶分别将eGFP 与pMIR-LUC-Smad7或pMIR-LUC-Smad7-MUT 酶切产物进行连接。测序正确的样品提取质粒并命名为pMIR-GFPSmad7 及pMIR-GFP-Smad7-MUT，存放于-80℃保存备用。

1.2.6 双荧光素酶检测 将处于对数生长期的HEK-293T 细胞接种于 96 孔板，24 h 后贴壁细胞达70%汇合率时进行转染。将合成的miR-20a-5p miR-mimics 或阴性对照 miR-NC 与已构建的pMIR-LUC-Smad7 或 pMIR-LUC-Smad7-MUT、质粒pRL-TK 共转染HEK-293T 细胞。转染24 h 后，用 Dual-Luciferase®Reporter Assay System 试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.7 GFP 抑制实验 将处于对数生长期的HEK-293T 细胞接种于24 孔板，24 h 后贴壁细胞达70%汇合率时进行转染。将miR-20a-5p miR-mimics 或miR-NC 与已构建的 pMIR-GFP-Smad7 或pMIRGFP-Smad7-MUT 共转染HEK-293T 细胞。转染24 h 后，先用OLYMPUS 倒置荧光显微镜观察拍照，然后经BD FACSVerseTM流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析处理。实验数据以表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组样本中两组间比较首先进行独立样本单因子变异数分析（one-way ANOVA），然后做 Tukey 或 Dunnett’s T3 检测。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-20a-5p 靶基因预测 根据靶基因预测数据库 TargetScan 7.2（http://www.targetscan.org/mmu_72/）对miR-20a-5p 的靶基因进行预测，将在转化生长因子（TGF）-β 信号通路中发挥抑制作用的 Smad 家族成员Smad7 选为miR-20a-5p 的候选靶基因。包括小鼠、大鼠及人等在内的11 个脊椎动物的Smad7 基因 3′UTR 都有保守的 miR-20a-5p 结 合种子序列 GCACTTT（图1）。

图1 miR-20a-5p 识别结合Smad7mRNA3′UTR 的生物信息学分析Fig 1 Bioinformatics analysis of miR-20a-5p binding to 3′UTR of Smad7 mRNA

2.2 荧光素酶报告基因载体的构建 以小鼠MC3T3-E1 细胞的cDNA 为模板，利用PCR 技术扩增长度为447 bp 的序列（图2A），经同源重组将扩增片段连接至荧光素酶报告载体pMIR-REPORTLuciferase，命名为 pMIR-LUC-Smad7。 pMIRLUC-Smad7 重组质粒及PCR 特异性扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳可见插入片段长度正确，经测序确定插入片段碱基序列亦正确（图2B 泳道1、2）。用点突变特异性引物扩增pMIR-LUC-Smad7 后进行同源重组构建得到miR-20a-5p 结合种子序列GCACTTT 突变为 CCTCATA 的重组质粒 pMIRLUC-Smad7-MUT（图3）。pMIR-LUC-Smad7-MUT重组质粒及PCR 特异性扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳可见插入片段长度正确，经测序确定插入片段碱基序列亦正确（图2B 泳道 3、4）。

图2 Smad7 mRNA 3′UTR 扩 增 、pMIR-LUC-Smad7、pMIRLUC-Smad7-MUT 构建及其 PCR 鉴定Fig 2 Amplification of Smad7 mRNA 3′UTR，construction and PCR identification of pMIR -LUC -Smad7 and pMIR -LUC -Smad7-MUT

图3 miR-20a-5p 识别结合Smad7 mRNA 3′UTR 种子序列及其突变序列Fig 3 The wildtype and mutant seed sequence of miR-20a-5p recognizing Smad7 mRNA 3′UTR

2.3 GFP 报告基因载体的构建 以质粒pMIRREPORT-eGFP 为模板，利用PCR 技术扩增长度为720 bp 的 eGFP 表达序列（图4 泳道2）。将 pMIRLUC-Smad7 及 pMIR-LUC-Smad7-MUT 分别经双酶切去除荧光素酶报告基因，然后将eGFP 表达序列分别插入上述两个载体，测序及PCR 扩增结果均显示插入eGFP 表达序列正确（图4 泳道3～6）。

图4 eGFP 扩增、pMIR-GFP-Smad7，pMIR-GFP-Smad7-MUT构建及其PCR 鉴定Fig 4 Amplification of eGFP，construction and PCR identification of pMIR-GFP-Smad7 and pMIR-GFP-Smad7-MUT

2.4 双荧光素酶活性检测 双荧光素酶活性检测结果显示，pMIR-LUC-Smad7 与 miR-mimics 共转染组与其对照组相比荧光素酶活性降低；而pMIRLUC-Smad7-MUT 与miR-mimics 共转染组与对照组相比，荧光素酶活性未见明显变化（图5）。

图5 双荧光素酶报告系统验证miR-20a-5p 与靶基因Smad7 mRNA 3′UTR 的相互作用Fig 5 Dual luciferase reporter system validated the interaction of miR-20a-5p with Smad7 mRNA 3′UTR

2.5 GFP 抑制实验 相关重组载体与miR-20a-5p miR-NC 及miR-mimics 共转染的细胞经倒置荧光显微镜观察可见，与对照组相比，pMIR-GFP-Smad7与miR-mimics 共转染组GFP 表达阳性细胞比例显著降低，而pMIR-GFP-Smad7-MUT 与miR-mimics共转染组与对照组相比GFP 表达阳性细胞比例未见显著差异（图6A）。流式细胞仪测定结果与倒置荧光显微镜观察结果一致，pMIR-GFP-Smad7 与miR-mimics 共转染组较其他组GFP 表达阳性细胞比例显著减少（图6B，6C）。

图6 GFP 抑制实验验证miR-20a-5p 与靶基因Smad7 mRNA 3′UTR 的相互作用Fig 6 GFP repression assay confirmed the interaction of miR-20a-5p with Smad7 mRNA 3′UTR

3 讨论

骨质疏松症是一种骨质流失的全身系统性疾病，流行病学调查结果显示，我国50 岁以上的人群中骨质疏松症患病率为：女性20.7%，男性14.4%。骨质疏松是多因素过程，其主要特征是骨量减少和骨密度降低。促进骨质形成、增加骨量是治疗骨质疏松的有效手段[7-8]。而骨形成与间充质干细胞的增殖以及向成熟的成骨细胞分化有关，因此，成骨分化是骨形成的一个关键因素[9-10]。

近年来的研究表明，大量miRNAs 参与成骨细胞的分化过程，在调节骨再生的过程中发挥着重要作用[11-12]。例如 microRNA-130a 通过靶向 Smurf2 基因的3′UTR 区促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[13]。miR-20a-5p 在人间充质干细胞中通过抑制人PPARγ 基因表达及调控BMP 信号通路，从而促进成骨分化[6]。然而，Zhou 等[4]的研究结果表明，通过microRNA 靶基因预测数据库并未预测到PPARγ为miR-20a-5p 的潜在靶基因；另外，miR-20a-5P不能改变小鼠PPARγ 3′UTR 构建体的荧光素酶活性；而且，miR-20a-5p 不能抑制小鼠PPARγ 基因蛋白水平的表达。因此，miR-20a-5p 在成骨分化过程中的靶向分子机制尚需进一步研究。

本研究首先通过生物信息学预测发现在TGF-β信号通路中发挥抑制作用的Smad 家族成员Smad7可能是miR-20a-5p 的潜在靶基因。Smad 家族转录因子是TGF-β 细胞因子信号转导通路的关键因子，该信号转导通路在动物胚胎发育和组织再生等多个生命进程中发挥重要作用。Smad7 能够通过和活化受体相互作用使TGF-β 信号通路失去活性而发挥抑制成骨分化的作用[14]。

为探究miR-20a-5p 对Smad7 的靶向作用，本研究首先成功将Smad7 3′UTR 克隆至双荧光素酶报告基因载体以及绿色荧光报告基因载体上，然后将构建成功的报告基因与miR-20a-5p mimics 或NC mimics 共转染HEK-293T 细胞，双荧光素酶活性检测和绿色荧光抑制实验结果显示，与对照组相比，miR-20a-5p 显著抑制报告基因载体表达的绿色荧光蛋白及荧光素酶活性，提示miR-20a-5p 可能通过直接作用于靶基因Smad7，在成骨分化中发挥调控作用。

综上，本研究结果表明：miR-20a-5p 能够直接靶向作用于 Smad7 的 3′UTR。而 Smad7 与 TGF-β信号通路有着十分密切的联系。因此，笔者将进一步研究确定miR-20a-5p 是否通过阻断靶基因Smad7 在TGF-β 信号通路中的抑制作用而促进成骨分化。对成骨调控机制的研究，将为骨质疏松等骨代谢相关疾病的治疗提供新的药物靶点。