病毒诱导基因沉默技术引入普通生物学实验教学实践

朱 峰, 纪兆林, 钱 坤

(扬州大学 园艺与植物保护学院， 扬州 225009)

普通生物学课程是生命科学领域的一门重要的专业基础课程，是多数高等院校生物类专业的入门课程和必修课程。普通生物学也是一门以拓宽学生知识层面，培养学生综合素质能力为目标的、综合性非常强的基础课程，涉及多方面的领域，包括植物学、动物学、微生物学、生态学、细胞学、遗传学、分子生物学和进化生物学等，具有实践性强和操作性强的特点[1]。它是后续专业课程的基础，因此该课程的教学质量的好坏将直接影响到学生对后续专业课程的学习。相对应的生物学实验是教学过程的重要组成部分，同时也是生物学学科生存和发展的基础。如何通过实验教学培养出理论与实践能力相结合的高素质人才，成为众多高校教育管理者和一线教师所关注和研究的问题[2]。当前普通生物学教学过程中，仍然有很多问题需要进一步解决，尤其是实验教学存在的问题还需要去探讨[3]。为此，笔者对此进行了积极的实践和探索。

1 传统教学中存在的问题

在实验教学过程中获得知识以及从实验教学中培养学生的实践能力无疑是非常重要的。由于很多高校存在经费预算紧张、实验条件落后等客观问题，并且普通生物学实验课程遵循动物、植物的系统发展而设定，多数实验是以验证性的、单个独立的小实验、演示实验为主开展的，缺乏系统性和连续性。虽然花费了大量时间与精力，但是学生缺乏兴趣、主动性差,并且参与程度不够，教学效果差。对学生的实验操作技能、独立工作能力和创新思维能力等的培养都不甚理想。

因此，为了能在实验教学中提高学生的学习兴趣和实验操作技能、培养学生的独立工作能力和创新思维能力，切实增强教学质量，笔者首次尝试将当前生物学研究前沿技术——病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术引入到普通生物学实验教学过程中，让学生成为实验的主导者，亲自参与到实验过程的具体步骤中，激发学习兴趣，提高实验操作技能，培养学生独立工作能力和创新思维能力。

2 VIGS的实验教学方案

2.1 实验原理

VIGS是在植物中发现的一种转录后基因沉默现象。当携带植物目标基因cDNA的病毒感染植物后，在RNA聚合酶的作用下，合成大量的双链 RNA，然后宿主体内具有核酸内切酶活性的Dicer酶将dsRNA切割为21 ～ 24 nt 的小分子干扰RNA。siRNA与一系列AGO家族蛋白结合形成沉默复合体，该复合体可以特异地与细胞质中的同源 RNA相互作用，切割降解目标mRNA，阻断翻译过程，从而抑制目标基因的表达[4-7]。当基因表达被抑制后，植物的表型或生理指标发生相应的变化，可对该基因的功能进行研究[8-11]。与其他植物基因功能研究方法如基因敲除、转基因技术等相比，VIGS技术具有周期短、低成本、构建简易、不需要遗传转化、当代可观察表型、克服基因家族功能冗余以及快速比较不同物种之间的基因功能的优势[11-12]。因此，VIGS技术是植物基因功能研究领域中最快速简便的手段之一[6]。

当前越来越多的植物病毒被研究和开发成病毒诱导的基因沉默载体，应用到不同的植物功能研究中。而目前烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)作为VIGS载体，已在多种不同植物物种如茄科植物烟草、番茄、马铃薯、辣椒、矮牵牛，十字花科拟南芥、锦葵科棉花等中成功应用，并表现出独特的优越性[13]。它具有多重优点：感染症状轻、构建载体简单、方便外源序列的插入、快速侵染整个植物体包括分生组织和花、沉默效率高、持续时间长。八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是植物体类胡萝卜素合成过程中的一种的关键酶，当PDS基因的表达被抑制时，植物失去了类胡萝卜素的光保护作用，植物叶片就会出现光漂白现象，叶片表现白化。和对照比较，具有明显的表型差异。因此很多研究者在开发VIGS载体时常常选择沉默PDS基因作为参照，监控病毒载体的侵染效率[14-15]。

2.2 实验目的

本实验以本生烟PDS基因为研究对象，实验设计包括本生烟RNA提取、反转录cDNA、基因克隆、载体构建、农杆菌转化、侵染植物等内容。PDS基因沉默后的表型直观并且快速，非常适合学生理解和掌握VIGS这一前沿技术方法。该实验具有综合性、设计性、探究性的特点，让学生成为实验的主导者，亲自参与到实验过程的具体步骤中，激发学习兴趣，提高实验操作技能，培养学生独立工作能力和创新思维能力。

2.3 实验材料

1)生物材料与试剂。本生烟幼苗、大肠杆菌DH5α、农杆菌GV2260、TRIzolTMReagent (Invitrogen)、SuperScript III Reverse Transcriptase反转录试剂盒(Invitrogen)、pCR®8/GW®/TOPO®定向TOPO®中间载体试剂盒(Invitrogen)、Gateway®LR ClonaseTMII Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、pTRV1质粒、pTRV2质粒、琼脂糖、卡那霉素、氨苄青霉素、利福平、链霉素、农杆菌侵染缓冲液(10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES、200 μmol/L 乙酰丁香酮)、LB培养基等。

2)实验仪器。PCR仪、电泳仪及水平电泳槽、凝胶成像仪、离心机、摇床、移液器、恒温培养箱、超净工作台、电子天平等。

2.4 方法与步骤

1)提取本生烟植株的总RNA和cDNA的获得。按照TRIzolTMReagent试剂盒操作说明书的步骤提取本生烟植株的总RNA。cDNA的获得可以依据SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)试剂盒操作说明书的方法进行反转录反应。

2)重组pTRV2-NbPDS载体构建及农杆菌转化。从NCBI数据库中查找到NbPDS基因序列，登录号为EU165355。根据NbPDS基因的全长cDNA序列，用Primer 5软件设计特异性引物：F：5′-ATCGAGCTGAATGAGGATGG-3′，R：5′-CCGAAATTTCATCAGGGAAA-3′。通过PCR扩增得到424 bp大小的NbPDS基因片段。按照pCR®8/GW®/TOPO®定向TOPO®中间载体试剂盒(Invitrogen)操作说明书将NbPDS基因部分序列克隆到pCR®8/GW®/TOPO®载体上，将该连接产物转化到DH5α感受态细胞中，然后利用质粒提取试剂盒提取质粒。通过PCR及测序验证。从保存的TRV2 DH5α菌液中提取pTRV2质粒。将上述的NbPDS片段基因按照Gateway®LR Clonase® ⅡEnzyme Mix操作说明书克隆到pTRV2载体上。转入DH5α感受态细胞中，提取质粒。通过PCR及测序验证。重组质粒命名为pTRV2-NbPDS，再通过冻融法将pTRV2-NbPDS重组质粒转入农杆菌GV2260感受态细胞。

3)农杆菌侵染。分别将pTRV1、pTRV2-NbPDS的农杆菌单菌落接种到5 mL LB 液体培养基(含50 mg/L Kan，50 mg/L Amp，50 mg/L Strep，25 mg/L Rif)，28 ℃振荡培养过夜。离心10 min(3000 r/min)，收集农杆菌菌体，倒上清后，利用侵染缓冲液将农杆菌菌体悬浮，通过分光光度计调节OD600值至1.0左右，室温静置 3 h后，将 pTRV1 的农杆菌悬浮液和pTRV2-NbPDS农杆菌悬浮液按照 1∶1 的比例均匀混合后，准备注射本生烟幼苗。用无针头的1 mL 无菌注射器通过压迫注射法将已混合的农杆菌悬浮液注入本生烟幼苗的下位叶片中，每株注射2片叶。对照组：注射pTRV2空载体的农杆菌。注射后的本生烟幼苗在温室里继续培养，大约1周后，NbPDS基因沉默的表型开始慢慢出现，注意观察和拍照。

2.5 实验结果

在注射pTRV2-NbPDS的植株后，大约8 d后，本生烟植株的上位叶片出现光漂白现象。白化首先出现在靠近叶柄处，然后从叶脉向边缘周围扩展，2周后部分叶片和植株茎段几乎完全白化，而对照植株中叶片没有变化。pTRV2-NbPDS的农杆菌注射本生烟15 d后的表型如图1-B所示，叶片完全白化，但是TRV空载体注射的本生烟没有出现明显差异(图1-A)。因此实验结果说明NbPDS基因的表达被抑制，已被成功沉默，VIGS实验体系已成功被建立。

TRV:00为带有空载体pTRV2的农杆菌注射本生烟15 d后的表型;TRV:NbPDS为带有pTRV2-NbPDS的农杆菌注射本生烟15 d后的表型

图1VIGS沉默NbPDS基因的表型

Figure 1 The phenotype ofNbPDS-silenced by VIGS inN.benthamiana

2.6 注意事项

1)提取烟草总RNA时，研磨要迅速，保持低温环境，避免RNA降解。2)选择本生烟幼苗(具有4～6片真叶的植株)来注射农杆菌悬浮液，不能选择生长周期过长的植株。3)调节农杆菌悬浮液的OD600值到1.0左右，不宜过高。4)侵染缓冲液要现配现用，有利于农杆菌的渗透性。5)注射不同VIGS载体时，应记得及时更换注射器和一次性手套，防止交叉污染。

2.7 思考题

1)为什么要将OD600值调节至1.0左右，而不能过高？2)VIGS的原理是什么？3)如何进一步通过实验证明本实验中NbPDS基因的表达被沉默？

3 教学效果

与传统的小实验相比，引入的VIGS实验具有明显的综合性、设计性和探究性的特点，是一个系统、连续的过程，类似于一个比较完整的科研过程。在实验过程中，学生成为实验的主导者，主动参与到实验过程的具体步骤中，学生非常认真地完成每个实验。因为前一实验结果直接决定了后一实验能否成功，相辅相成，环环相扣。当学生最终发现自己将NbPDS基因沉默后，叶片出现白化现象，学生非常激动和兴奋，觉得非常神奇，学生彼此之间的交流、沟通、讨论也非常激烈，成就感和满足感油然而生，学生的兴趣显著提高。不过也有部分学生最终没有观察到叶片白化现象，出现一定的失望情绪，这时需要鼓励他们耐心去思考实验的每个环节，在哪些地方有问题。结合注意事项和思考题反复推敲，最终找到问题的根源，可以尝试再做一次。从学生的反馈情况来看，学生们普遍喜欢该实验，许多学生认为从该实验中得到了多方面的锻炼，既开阔了眼界，拓展了思路，更进一步理解和巩固了所学的理论知识。

4 结语

由于利用VIGS技术将PDS基因沉默后的表型具有直观性、显著差异性和快速性等特点，因此非常适合将该实验技术引入到本科实验教学中，生物学的基本原理可以在实验过程轻松的被理解和掌握，实现理论与实践能力相结合的培养，对拓展学生的创新思维，提高科研能力有很好的帮助。也为他们今后继续深造和工作打下坚实基础。