浮小麦5-二十一烷基间苯二酚提取与测定方法优化及指纹图谱研究

王鹏飞，刘 娇，高 速，张 姣，张 晗,2，杨 琳,2，王小平*，白吉庆,2**

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药原料质量监测技术服务中心，陕西 咸阳 712046)

浮小麦为禾本科植物小麦TriticumaestivumL.的干燥轻浮瘪瘦的果实[1-2]，始载于《本草纲目》[3]，其性凉，味甘咸，入心、脾、肾经，具有止汗、除热、益气、养心安神的功效，对自汗、盗汗、骨蒸劳热、心神不宁、惊悸等疾病有较好的疗效[4-7]。现行2015年版《中国药典》四部仅在“成方制剂中本版药典未收载的药材饮片”中记载了浮小麦的来源，未对浮小麦药材质量控制做进一步要求。据报道，其含有5-二十一烷基间苯二酚、亚油酸、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、棉子糖等多种成分[5,8]。其中文献报道5-二十一烷基间苯二酚具有止汗，能抑制大鼠足趾部位汗点数等作用[5,9-10]，与浮小麦的功能主治相一致。基于此，采用HPLC对14批浮小麦中5-二十一烷基间苯二酚含量进行了测定，并建立了浮小麦的指纹图谱，为浮小麦的质量控制和评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

戴安Ultimate 3000全自动高效液相色谱仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司，包含Ultimate 3000四元梯度泵、Ultimate 3000自动进样器、Ultimate 3000二极管阵列检测器、chromeleon 6.8色谱工作站)；Discovery DV215CD型双量程电子分析天平(瑞士赛多利斯集团；0.01 mg；0.1 mg)；Direct-Q 3UV纯化水机(默克密理博)；超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；DFT-50A手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司制造)。

1.2 试验药材与试剂

浮小麦经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定为禾本科植物小麦(TriticumaestivumL.)的干燥轻浮瘪瘦的果实，来源信息见表1；5-二十一烷基间苯二酚对照品(江西佰草源生物科技有限公司，BCY-01581，质量分数≥98%)；乙腈、甲醇(美国迪马公司，色谱级)；水为超纯水(自制)；其他试剂均为分析纯。

表1 浮小麦样品来源信息

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺优化

以5-二十一烷基间苯二酚含量为评价指标，按L9( 34) 正交试验表安排试验，并进行极差和方差分析。考察甲醇浓度(A) 、超声时间(B) 、提取次数(C)3个因素，每个因素3个水平。因素水平表见表2。

表2 浮小麦5-二十一烷基间苯二酚提取工艺因素水平表

Table 2 Factors and levels of extraction technology of 5-heneicosyresorcinol from aestivum

水平因素ABC甲醇浓度/%超声时间/min提取次数1501512703023100453

1.3.2 5-二十一烷基间苯二酚含量测定

1.3.2.1 色谱条件 Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(95.7∶4.3)，流速为1 mL·min-1；检测波长205 nm；柱温30℃；进样量20 μL。

1.3.2.2 对照品溶液制备 精密称取5-二十一烷基间苯二酚对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇制成0.093 mg·mL-1的对照品溶液，备用。

1.3.2.3 供试品溶液制备 取浮小麦粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇6 mL，称定重量，超声处理(80 W，45 kHz)30 min，放冷，再次称定重量后，用甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22 um微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.3.2.4 线性关系 用甲醇将“2.1.2”项下所制对照品溶液逐级稀释成质量浓度分别为0.0186、0.02976、0.0372、0.0558、0.0744、0.093 ug·mL-1，按“2.1.1”项下色谱条件依次进样1 μL测定，记录峰面积，以其质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，线性回归。

1.3.2.5 精密度试验 取同一供试品溶液，按“1.3.2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录5-二十一烷基间苯二酚的峰面积。

1.3.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h，按“1.3.2.1”项下的色谱条件进样，记录5-二十一烷基间苯二酚的峰面积。

1.3.2.7 重复性试验 取S1浮小麦样品，平行6份，按“1.3.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.2.1”项下色谱条件进样分析，记录5-二十一烷基间苯二酚的峰面积。

1.3.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的浮小麦样品粉末(S1)6份，每份0.05 g，分别精密加入一定量的5-二十一烷基间苯二酚对照品，按“1.3.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.2.1”项下色谱条件进行测定，计算平均回收率。

1.3.2.9 样品含量测定 取14批浮小麦样品各0.1 g，按照“1.3.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.2.1”项下色谱条件进行含量测定，供试品和对照品色谱图见图1。

1.3.3 指纹图谱

1.3.3.1 色谱条件 Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0～60 min，70% B；60～80 min，0%B)；流速为1mL·min-1；检测波长205 nm；柱温40℃；进样量20 μL。

1.3.3.2 精密度试验 取同一供试品溶液，按“1.3.3.1”项下色谱条件连续进样6次，以3号峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，对色谱图进行相似度分析。

1.3.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h，按“1.3.3.1”项下色谱条件进样，以3号峰为参照峰，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，将色谱图进行相似度分析。

1.3.3.4 重复性试验 取S1浮小麦样品，平行6份，按“1.3.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3.1”项下色谱条件进样分析，以3号峰为参照峰，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，将色谱图进行相似度分析。

1.3.3.5 浮小麦指纹图谱的建立 取14批浮小麦药材样品，按“1.3.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.3.1”项下色谱条件测定，记录14批浮小麦样品的色谱图。导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A)软件进行分析，以样品S1的指纹图谱为参照图谱，采用平均数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.1 s，经多点校正、自动匹配后生成浮小麦药材指纹图谱的共有模式，见图2。

图1 浮小麦(A)及5-二十一烷基间苯二酚对照品(B) HPLC色谱图Fig.1 HPLC of aestivum (A) and 5-heneicosyresorcinol Reference (B)

图2 14批浮小麦HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of 14 batches ofaestivum

2 结果

2.1 5-二十一烷基间苯二酚提取工艺优化

由表3可知，甲醇浓度对5-二十一烷基间苯二酚的提取有统计学意义，其中甲醇提取5-二十一烷基间苯二酚含量最高；提取时间和提取次数没有统计学意义，但是提取30 min比提取15 min的含量高，提取次数对含量影响不大。综合考虑，即要5-二十一烷基间苯二酚提取含量最高，又要节约成本，所以确定较佳提取工艺为A3B2C1，即用甲醇超声30 min提取1次。

表3 优化5-二十一烷基间苯二酚提取工艺的正交试验结果

表4 5-二十一烷基间苯二酚含量方差分析结果

2.2 色谱条件的优化

采用二极管阵列检测器对指纹图谱和含量测定的检测波长进行选择。结果表明，检测波长在205 nm处所得各色谱峰谱图信息量较大，且色谱峰分离度较好，故选用205 nm为检测波长。采用不同的洗脱系统对流动相的组成进行优化，5-二十一烷基间苯二酚含量测定最终选用“1.3.2.1”项下的色谱条件进行等度洗脱。指纹图谱最终选用“1.3.3.1”项下的色谱条件进行梯度洗脱，各色谱分离度好。

2.3 5-二十一烷基间苯二酚含量测定

所得回归方程为：y=39.215x-0.0155，r =0.9996， 5-二十一烷基间苯二酚质量在0.0186～0.093 ug·mL-1范围内呈现良好的线性关系；精密度试验中5-二十一烷基间苯二酚峰面积的RSD值为1.30%，表明仪器精密度良好；稳定性试验中5-二十一烷基间苯二酚峰面积的RSD值为1.60%，表明24 h内供试品的稳定性良好；重复性试验中5-二十一烷基间苯二酚含量的RSD值为1.24%，表明该方法的重复性良好；计算平均回收率为101.16%，RSD为0.7%，表明该方法的回收率良好。 14批浮小麦中5-二十一烷基间苯二酚含量分别为3.74、4.51、4.29、 5.02、2.96、2.90、3.38、1.62、3.30、2.35、2.77、2.73、3.17、3.33 mg·g-1。

2.4 指纹图谱

2.4.1 方法学考察

精密度试验中，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.12%～0.50%，0.17%～2.91%，相似度均大于0.990，表明仪器精密度良好；稳定性试验中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.08%～1.93%，0.45%～2.99%，相似度均大于0.990，表明24 h内供试品的稳定性良好；重复性试验中，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.06%～1.04%，0.67%～2.98%，相似度均大于0.990，表明该方法的重复性良好。

2.4.2 共有峰标定

根据14批浮小麦药材指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A)软件，共确定出18个共有色谱峰，见图3。经对照品比对指认了Rt = 60.780 min为5-二十一烷基间苯二酚的色谱峰。在样品图谱中选择峰面积较大3号色谱峰作为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算其他各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5、6。

2.4.3 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价体系统》(2004 A)对14批浮小麦的指纹图谱数据进行分析，与共有模式相比较，S11相似度为0.988，其余样品相似度均达到0.99以上，表明药材质量稳定，差异较小，结果见表7。

2.4.4 系统聚类分析

对14批浮小麦样品的HPLC指纹图谱中18个共有峰的峰面积数据导入SPSS 22.0统计分析软件，采用组间联接法，以欧式平方距离对样品进行聚类分析。当临界值为20时，14个来自不同产地的浮小麦样品可聚为两类：第1类为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12、S13、S14；第2类为S11，结果见图4。

图3 12-5-二十一烷基间苯二酚浮小麦药材HPLC指纹图谱共有模式(A)和5-二十一烷基间苯二酚对照品色谱图(B)Fig.3 HPLC fingerprints common model (A) and reference chromatography of 5-heneicosyresorcinol (B)

共有峰相对保留时间S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14RSD/%10.7890.7970.7900.7900.7890.7900.7900.7900.7890.7900.7900.7890.7880.7890.2720.9600.9590.9600.9590.9600.9600.9600.9580.9590.9600.9590.9590.9580.9600.013(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0041.4121.4101.4111.4111.4111.4101.4551.4521.4121.4001.4101.4111.4101.4100.8851.7671.7661.7691.7681.7681.7671.7681.7681.7681.7621.7651.7671.7671.7670.1061.8941.8921.8941.8931.8921.8921.8941.8941.8931.8791.8911.8931.8931.8920.2171.9411.9381.9401.9441.9401.9381.9401.9391.9391.9331.9381.9391.9391.9380.1282.402.372.392.392.402.412.402.402.392.392.392.412.402.390.1292.5262.5222.5252.5232.5232.5242.5242.5232.5232.5122.5212.5242.5222.5220.13102.5412.5372.5402.5382.5382.5392.5392.5402.5392.5122.5362.5402.5392.5340.28112.6432.6392.6422.6402.6402.6412.6412.6412.6402.6282.6342.6412.6392.6380.14122.6692.6652.6682.6662.6662.6672.6682.6672.6672.6542.6642.6682.6652.6650.14132.7432.7382.7422.7392.7392.7412.7412.7412.7402.7272.7372.7412.7392.7380.14142.7932.7882.7922.7902.7902.7902.7892.7922.7892.7772.7872.7912.7892.7880.14152.8522.8472.8512.8522.8492.8492.8502.8502.8492.8352.8462.8502.8452.8470.17162.8742.8692.8732.8702.8712.8712.8722.8722.8722.8572.8672.8722.8702.8690.14172.9452.9452.9442.9412.9422.9422.9432.9442.9432.9292.9402.9432.9412.9400.14182.9802.9802.9782.9752.9762.9762.9782.9772.9632.9763.0622.9772.9742.9750.78

表6 14批样品共有峰的相对峰面积

续表6 14批样品共有峰的相对峰面积

表7 14批浮小麦相似度分析结果

图4 14批浮小麦系统聚类分析结果Fig.4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 14batches of aestivum

3 讨论与结论

5-二十一烷基间苯二酚是浮小麦中主要活性成分之一，具有止汗、能抑制大鼠足趾部位汗点数、抑制α-葡萄糖苷酶活性，控制餐后高血糖等作用[9,13]，测定其含量对浮小麦的质量控制具有重大意义。目前，对于浮小麦的质量控制研究主要集中在葡萄糖、棉子糖、亚油酸等化学成分的含量测定[5,11]、生药学[4,12]等方面，未见对浮小麦药材的指纹图谱研究。本研究采用HPLC法测定了14批浮小麦中5-二十一烷基间苯二酚含量在1.62～5.02 mg·g-1之间，平均加样回收率为101.16%，RSD为0.7%；建立了不同产地浮小麦的HPLC指纹图谱，标定了18个共有峰，指认了5-二十一烷基间苯二酚1个共有峰。方法学结果表明其精密度、重复性、稳定性良好。

从聚类分析结果可知，广西玉林药材市场浮小麦(S11)与陕西大多数产地浮小麦差异较大，说明不同省之间浮小麦的质量存在差异，而陕西各批浮小麦相似度均在0.99以上，说明差异较小，质量比较稳定。经系统聚类分析，其结果与指纹图谱的相似度分析结果项一致。

综上分析，本文建立的浮小麦指纹图谱及含量测定方法对其质量控制和评价研究具有重要意义，可为浮小麦药材质量标准的制定提供实验依据。