茵陈浸提物抑制尿素酶活性提取工艺优化

赵兴坛, 崔雪微, 张 全, 闫 梅, 王旖旎, 张孝林

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，世界上约有50%以上的人口感染该菌，幽门螺杆菌感染患者易发生胃炎、十二指肠和胃溃疡等疾病[1]。世界卫生组织已确定幽门螺杆菌为Ⅰ类致癌原。相关研究证实，幽门螺杆菌感染者其患胃癌风险明显升高[2]。现在治疗幽门螺杆菌感染采用的主要方法是利用一种质子泵结合两种抗生素的“三联”疗法，有一定的治疗效果。但抗生素治疗存在病人需口服大剂量抗生素和较长的治疗周期，这些导致治疗副作用大，病人的依从性比较差[3]。特别是随着幽门螺杆菌对抗生素耐药菌株的不断出现，用抗生素根治幽门螺杆菌其根治率越来越低，这已成为幽门螺杆菌感染康复治疗的重大医学难题[4]。因此，寻求一种新的治疗手段治疗幽门螺杆菌感染将具有重大的医学价值和社会价值。幽门螺杆菌定植在胃黏膜中，其生存的环境是呈现强酸性的，研究发现幽门螺杆菌能存活在胃黏膜酸性环境中与幽门螺杆菌具有强的尿素酶活性相关，幽门螺杆菌的尿素酶蛋白占总蛋白达到6%～10%[5]。幽门螺杆菌利用尿素酶分解尿素释放氨气，在幽门螺杆菌的周围形成氨云，使其存活的环境呈弱碱性[6]。幽门螺杆菌一旦失去尿素酶活性，处在酸性环境中，幽门螺杆菌是不能存活的。同时，幽门螺杆菌的尿素酶存在于细菌的细胞质和细胞表面，是幽门螺杆菌的毒力因子，在幽门螺杆菌定植于胃黏膜中发挥着重要作用。因此，发现一种尿素酶抑制剂使幽门螺杆菌的尿素酶丧失活性，幽门螺杆菌将不但丧失产生存活所需的弱碱性环境，而且幽门螺杆菌也失去其在胃黏膜定植的能力，进而达到根除幽门螺杆菌在胃中定植的作用。研究发现一些植物含有的活性成分具有很强的尿素酶抑制作用[7]。前期对一些中药的浸提物抑制尿素酶活性进行筛选研究，发现茵陈浸提物对尿素酶活性具有较强的抑制作用。同时发现植物的活性成分的提取与多种因素有关，其中影响最大的因素是料液比、浸提温度和浸提时间。本研究对这三因素从单因素考察后，设计正交试验确立茵陈的浸提物抑制尿素酶活性的最佳工艺条件，为进一步把茵陈开发成用于防治幽门螺杆菌感染提供理论依据和技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茵陈(ArtemisiacapillarisThunb)购于凤阳华佗大药房(经安徽科技学院药学系毛斌斌老师鉴定为正品)；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、苯酚、次氯酸钠、硝普钠、尿素(AR)、刀豆尿素酶等试剂均为分析纯，购于国药集团有限公司；试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器

HH-8数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；FA21048电子天平(上海市精密科学仪器总厂)；SpectraMax190型酶标仪(美国MD全波长酶标仪)；真空冷冻干燥机(德国Martin Christ公司)。

1.3 方法

1.3.1 正交试验考察的因素的确定 茵陈浸提物对抑制尿素酶活性有较大影响的浸提因素主要是浸提温度、浸提时间和料液比。本研究以茵陈浸提物对尿素酶活性抑制率为指标，以上述3因素为考察对象，设计正交试验，确立茵陈浸提物影响抑制尿素酶活性的最佳浸提工艺条件。

1.3.2 茵陈浸提物对尿素酶活性的抑制作用——靛酚蓝法 尿素酶活性的检测主要利用尿素酶具有催化尿素生成氨的作用，检测生成氨的量就可知道尿素酶的活性。氨在弱碱性溶液中能与次氯酸钠发生反应生成氯胺，氯铵在硝普钠作为催化剂情况下与酚作用生成靛酚蓝，靛酚蓝的最大吸收波长是在625 nm处。本研究根据文献[8]测定浸提物对尿素酶活性的抑制率：

(1)溶液的配置：① 50 mM磷酸钾缓冲液配制：KH2PO41.701 5 g溶于100 mL去离子水中；K2HPO42.177 5 g溶于100 mL去离子水中；两溶液混合后定容至1 000 mL；②溶液A的配制：0.5 g苯酚，2.5 mg硝普钠溶于45 mL缓冲液中，定容至50 mL；③溶液B的配制：0.25 g NaOH 0.42 mL 5%次氯酸钠 溶于45 mL缓冲液中，定容至50 mL；④ 300 mM尿素溶液的制备：1.8 g尿素溶于90 mL缓冲液，再定容至100 mL。

(2)1 mL反应体系组成和抑制率测量：①在1.5 mL的离心管中分别加入茵陈浸提物0.1 mL和生理盐水0.1 mL(作为对照)然后再分别加入20 IU/mL尿素酶贮备液 0.05 mL，最终尿素酶在1 mL反应体系浓度为1 IU/mL；小心混匀后在37 ℃ 温浴10 min；②分别加入溶液A： 0.25 mL， 溶液B：0.25 mL；③分别加入300 mM尿素贮备液0.1 mL，最终尿素的最终浓度为30 mM，每个试管加入缓冲液0.25 mL，小心混匀后在37 ℃ 温浴30 min。分别取0.2 mL至96孔酶标板，每个样品作3个平行，在630 nm处检测吸光度值后求平均值。对照组为Ao，样品茵陈浸提液组为A。

茵陈浸提液对尿素酶活性的抑制率按下列公式计算：

抑制率(%)=(Ao-A)/Ao×100%

1.3.3 茵陈浸提物对尿素酶活性抑制作用的单因素考察

1.3.3.1 影响浸提物抑制尿素酶活性的温度试验 称取2 g茵陈分别加入5个锥形瓶，再向锥形瓶中加入42 mL去离子水(料液比1∶21)，水浴温度依次为50、60、70、80、90 ℃，提取时间100 min，浸提物进行抽滤，把滤液真空冷冻干燥，用10 mL去离子水进行稀释配置溶液，进行茵陈浸提物对尿素酶活性抑制率检测。

1.3.3.2 提物抑制尿素酶活性的浸提时间试验 称取2 g茵陈分别加入5个锥形瓶，向5个锥形瓶中加入42 mL去离子水(料液比1∶21)，浸提温度80 ℃，浸提时间为60、80、100、120、140 min，浸提物进行抽滤，把滤液真空冷冻干燥，用10 mL的去离子水进行稀释配置溶液，进行茵陈浸提物对尿素酶活性抑制率检测。

1.3.3.3 影响浸提物抑制尿素酶活性的料液比试验 称取2 g茵陈分别加入5个锥形瓶，向5个锥形瓶中分别加入30、36、42、48、54 mL去离子水，相当于料液比1∶15、1∶18、1∶21、1∶24、1∶27，浸提温度为80 ℃，浸提时间100 min, 浸提物进行抽滤，把滤液真空冷冻干燥，用10 mL的去离子水进行稀释配置溶液，进行茵陈浸提物对尿素酶活性抑制率检测。

1.3.4 正交试验设计 依据1.3.3节单因素试验结果，选取3个茵陈浸提物对尿素酶活性较好抑制率的浸提条件，确立单因素合适的三水平，设计三因素三水平正交试验获得茵陈浸提物对尿素酶活性抑制率最大的浸提工艺条件。因素水平如表1所示,正交试验结果如表2所示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验的结果

2.1.1 温度对浸提物抑制尿素酶活性的影响 温度对浸提物抑制尿素酶活性的影响如图1所示。浸提温度从50 ℃到80 ℃时随着浸提温度的升高时，茵陈浸提物抑制尿素酶活性逐渐增大，当浸提温度从80 ℃到90 ℃时，茵陈浸提物抑制尿素酶活性没有增大反而有所下降。出现这种现象的原因可能是，开始随着温度的不断升高有利于活性成分从茵陈中浸出，但茵陈浸提物抑制尿素酶活性的成分对高温存在敏感性，当温度过高时，造成浸提物中抑制尿素酶活性成分被破坏。因此，茵陈浸提时浸提温度不宜太高，确定80 ℃为茵陈的最佳浸提温度。

图1 温度对浸提物抑制尿素酶活性的影响

图2 时间对浸提物抑制尿素酶活性的影响

2.1.2 浸提时间对浸提物抑制尿素酶活性的影响 浸提时间对浸提物抑制尿素酶活性的影响如图2所示。浸提时间从60～100 min时随着浸提时间的延长浸提物对尿素酶活性逐渐增大，当浸提时间从100～140 min继续增加时，获得的茵陈浸提物抑制尿素酶活性不但没有增大反而有所下降。出现这种现象的原因可能是，开始随着浸提时间延长有利于茵陈抑制尿素酶活性成分从茵陈中浸出，在浸提100 min时活性成分已基本浸出，如果再继续延长浸提时间，已浸出的茵陈活性成分在较高浸提温度下被破坏。这也进一步证实上述随着浸提温度升高到80 ℃后，茵陈浸提物抑制尿素酶活性不升反降，对茵陈抑制尿素酶活性成分热不稳定性我们将做进一步研究。因此，茵陈浸提物具有较好抑制尿素酶活性的浸提时间确定为100 min。

2.1.3 料液比对浸提物抑制尿素酶活性的影响 料液比对浸提物抑制尿素酶活性的影响如图3所示。浸提时间从1∶15到1∶27提取溶剂的量增加几乎1倍。从图3可以看出从1∶15到1∶21时，随着料液比的增加浸提物对尿素酶活性逐渐增大，当料液比从1∶21到1∶27时，茵陈浸提物抑制尿素酶活性并没有继续增大。出现这种现象的原因可能是，开始随着料液比的增加有利于抑制尿素酶活性成分从茵陈中浸出，当料液比也就是提取溶剂继续增大时，因抑制尿素酶活性成分已基本从茵陈中浸出，再继续增大溶剂剂量时，浓缩获得相同体积的茵陈浸提物对尿素酶活性的抑制率不再继续增大。考虑浸提物浓缩需蒸发，溶剂量越多蒸发消耗的能源越多，成本越高，因此，当料液比为1∶21时，获得茵陈浸提物不但具有较好抑制尿素酶活性，而且具有很好的经济性。

图3 料液比对浸提物抑制尿素酶活性的影响

2.2 正交试验因素与水平的确立及正交试验结果

2.2.1 正交试验因素和水平确立 根据单因素获得抑制尿素酶活性的浸提因素的浸提条件，设计下列正交试验各因素水平如表1所示:

表1 正交试验各因素水平

2.2.2 正交试验结果 按照1.3.2试验方法和单因素试验结果确立的三因素和三水平进行正交试验，测得茵陈浸提物对尿素酶活性的抑制率结果如表2所示。根据表2对试验结果进行分析，3个因素的极差R可知：茵陈浸提物对尿素酶活性抑制率在三因素中，浸提温度A因素影响最大，其次是浸提物料液比B因素影响较大，浸提时间C因素在影响浸提物抑制尿素酶活性中最小。茵陈浸提物对尿素酶活性的抑制率的最佳浸提条件组合是A2、B2、C3，即浸提温度80 ℃，浸提时间100 min及料液比为1∶24的浸提条件下所获得的茵陈浸提物对尿素酶活性的抑制率最大。浸提最佳组合条件A2、B2、C3存在于正交试验表中，茵陈浸提物对尿素酶活性的抑制率可达到85.67%，说明茵陈浸提物对尿素酶活性有较好的抑制功能。进一步进行方差分析结果如表3所示：F0.10(2,2)=9，F0.05(2,2)=19，F0.01(2,2)=99，所以，A因素的F>F0.05，具有显著性，B、C因素不具显著性。说明A因素浸提温度对茵陈浸提物抑制尿素酶活性具有显著意义，且非常重要与极差分析具有一致性。

表2 方差分析

表3 抑制率正交试验结果

3 结论与讨论

相关研究证实抑制幽门螺杆菌尿素酶活性可杀灭幽门螺杆菌在胃中的定植[8]，寻找一种天然活性成分对尿素酶活性的作用[8]，以期探究一种新的防治幽门螺杆菌在胃中定植的新方法具有重要的价值。现有的抗生素治疗幽门螺杆菌时，幽门螺杆已产生了耐药性，使抗生素治疗幽门螺杆菌的根除率逐渐降低。另外，抗生素治疗为了达到理想的治疗效果，加大用药剂量和延长用药周期，这不但增加了用药成本，也使抗生素对人体的副作用进一步增大。茵陈是一种常见的中草药，茵陈具有多种生理学功能[9]。临床主要用于治疗黄疸、肝炎、慢性肝病、胆囊炎等肝胆疾患。在治疗肝病的方剂中茵陈使用剂量较大可达到六两,约82.8 g，说明茵陈临床应用比较安全[10]。

本研究在尿素酶活性抑制作用试验采用的是更加灵敏的靛酚蓝法，而不是传统的酚红试验方法。研究发现，茵陈浸提物对尿素酶活性有非常强的抑制作用，实验同时证实，茵陈浸提物的抑制尿素酶活性虽然受浸提温度、浸提时间和料液比都有影响，但浸提温度影响最大，其次是料液比，可能是抑制尿素酶活性的茵陈浸提物活性成分对高温存在敏感性，这是很多中药活性成分通常存在的共性。本研究只是对具抑制尿素酶活性茵陈浸提物进行初步的研究，对具抑制尿素酶活性的茵陈浸提物具体成分还有待进一步深入研究。