体外模拟消化对四种杂粮中酚类物质及其降脂活性的影响

姚轶俊 李枝芳 王立峰 鞠兴荣

(江南大学食品学院1，无锡 214122) (南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心2，南京 210023)

杂粮是指除稻米、小麦、玉米等主粮以外的谷物，主要包括高粱、燕麦、荞麦、薏米、青稞、红豆、黑豆、芸豆、豌豆等。杂粮一般种植在相对特殊的地区，种植面积小、产量较低，但是含有丰富的营养成分[1]。近年来研究表明，杂粮中富含植物化学成分，如酚酸、黄酮、花青素、植物甾醇等，他们在体外实验中表现出了比传统主粮及水果更高的生理活性[2]。相关流行病学研究指出，杂粮类食品的长期摄入可以有效降低心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、结肠癌和脑卒中等慢性病的发病率，并且有助于控制体重[3]。同时，我国杂粮产量约占世界杂粮总产量的17.1%，占国内粮食总产量的10.0%。我国居民膳食指南建议每日粗杂粮的摄入量为50～100 g，但调查结果显示，成年人每日粗杂粮的摄入量仅为14 g，不到推荐摄入量的1/3，且食用种类单一[4]。因此，杂粮及相关食品在我国具有十分广泛的研究及利用前景。

随着人们生活水平的提高和饮食结构所发生的变化，目前肥胖与超重在世界范围内日益增加，与之直接相关的疾病发生率也不断上升。其特点是死亡率高、复发率高，一旦形成较难治愈[5]。奥利司他是目前市场上治疗肥胖最为畅销的药物之一，但是有较多的副作用，如油性斑点、便秘、腹泻等[6]。研究表明多酚类化合物能够阻断脂质的过氧化反应，通过抑制血小板凝集和诱导血管舒张那个等改善血液的流变性，从而有效缓解心脑血管疾病的发生[7，8]。杂粮中除了碳水化合物、脂质、蛋白质、矿物质、维生素等营养物质以外，还富含具有生物活性功能的酚类化合物，包括酚酸、香豆素、单宁酸、黄酮类化合物、烷基间苯二酚等[9]。已有研究证明，糙米、玉米、燕麦等谷物中结合多酚占50%以上，而薏米、荞麦、青稞等谷物中则以游离多酚为主[10，11]。因此杂粮类食品的降脂功能也越来越得到人们的关注。

近年来，对杂粮降脂功能的研究多建立在在体外实验或动物模型的基础上。然而食品本身的活性成分及其功能并不能完全等同于其对人体的功能，诸多因素都会影响活性成分在人体内的利用率，如该物质在胃肠道消化过程中的稳定性、从大分子组分中释放出来的稳定性、与其他食品组分的交互影响以及通过小肠细胞的难易程度等[12]。因此，研究消化过程对活性成分的影响对于功能性的杂粮食品来说具有重要的意义。Glahn等[13]研究发现，利用体外消化模型测定铁离子的生物利用率与人体实验获得的数据基本一致。体外模拟胃肠道消化作为一种方便、快捷、低成本的方式，可以有效地反映出食物在人体内消化吸收过程中的变化，已被广泛地应用于食品活性组分在人体内的消化吸收情况以及加工工艺对食品组分生物利用率的相关研究中[14，15]。同时由于动物实验存在周期长、个体差异大、影响因素众多和实验条件不易控制等缺点，因此培养周期短、成本低、最接近人体反应的人体肝癌细胞HepG2被广泛应用于食品功能成分的研究[16，17]。因此，研究体外模拟消化对杂粮中酚类物质的影响及其降脂活性具有重要的意义。

因此，本研究以我国常见的4种杂粮(薏米、荞麦、青稞、红豆)为原料，构建体外消化模型研究四种杂粮在消化过程中酚类物质含量的变化；并基于HepG2细胞构建高脂模型，对上述四种杂粮消化液中多酚提取物进行降脂活性的评价，为进一步研究其作用机制及扩充现代人的健康膳食选择、预防慢性疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

薏米(辽宁5号Coix lachryma-jobi L.)、荞麦(大三棱Fagopyrum esculentum Moench.)、青稞(北青3号Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook.f.)、红豆(天津红Abrus precatorius L.)，当季采收后在阴凉避光条件下储藏，并在3个月内使用；乙醇、正己烷、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶；猪胆汁、荧光素钠盐、水溶性维生素E、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化钙等均为化学纯；乙腈、三氟乙酸、噻唑蓝 ( MTT )、二甲基亚砜 ( DMSO) 等均为分析纯；人体肝癌细胞株HepG2、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素、甘油三酯(TG)测试盒(A110-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒(A111-1)。

1.2 仪器与设备

SX-500快速自动高压灭菌锅；FW100高速粉碎机；Beckman Coulter J6高速冷冻离心机； pHS-3C型精密数显pH计；THZ-D台式恒温振荡器；ALpHA2-4型真空冷冻干燥机；SpectraMax M2e酶标仪；Milli-Q Academic超纯水系统。

1.3 方法

1.3.1 样品熟化

分别取4种杂粮(薏米、荞麦、青稞、红豆)各20 g，按原料与水1∶9(质量比)加蒸馏水于器皿中，用电磁炉以1 800 W功率加热，待水开始沸腾后再分别蒸煮25 min， 并在蒸煮后关掉电磁炉焖制10 min。冷却至室温后用料理机匀浆3 min。

1.3.2 模拟体外消化

将熟化后的4种杂粮均浆各200 mL装在消化瓶中，并放置于37 ℃、100 r/min的恒温水浴摇床中，加入含有10.00 mg唾液α-淀粉酶的CaCl2溶液15 mL(1 mmol/L、pH 7.0)消化反应30 min，模拟口腔消化阶段；然后，用6 mol/L HCl将其pH调节至2.00，加入溶解有0.25 g胃蛋白酶的HCl溶液(0.1 mol/L、5 mL)，消化120 min，模拟胃消化阶段；最后用1 mol/L的NaHCO3将pH调节至7.0，随后加入溶解有0.25 g胰酶和0.70 g胆酸的NaHCO3溶液(0.5 mol/L、10 mL)，消化180 min，模拟小肠消化阶段[18，19]。取上述各阶段消化液5 mL，10 000 r/min离心10 min取上清液，再分别按照体积比1∶1加入80%的丙酮除去剩余的蛋白和多糖，10 000 r/min离心10 min取上清液，旋转蒸发并冻干后于-20 ℃保存备用。

1.3.3 活性物质测定

总酚(TP)测定：1 mg样品溶于1 mL 80%的丙酮溶液，取100 μL样品溶液(或没食子酸标准溶液)与400 μL去离子水混合，接着与0.1 mL的福林酚溶液混合，在避光条件下放置5 min，和1 mL 7%的碳酸钠溶液和0.8 mL的去离子水混合，在室温下避光反应90 min，将200 μL最终反应溶液添加到96孔板中，使用酶标仪在760 nm处测定吸光度。没食子酸在该实验中作为标准品，最终结果表示为没食子酸/样品(mg/g)[20]。

总黄酮(TPC)测定：称取试样0.3 g，置于25 mL试管，用80%丙酮溶解置刻度，混匀，超声提取40 min， 冷却至室温，定容，摇匀，离心。取离心后的上清液1 mL于蒸发皿中，加2 g聚酰胺粉吸附，于水浴锅上蒸干挥去乙醇，转入层析柱，用20 mL乙醚分多次洗脱除杂，后用甲醇洗脱黄酮，定容至25 mL，于360 nm测定其吸光度。以芦丁为标准品采用校正曲线法计算其总黄酮含量[21]。

1.3.4 细胞培养

HepG2细胞培养在含10%胎牛血清、50 units/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，培养环境为37 ℃，5% CO2。

1.3.5 细胞毒性测试(MTT)

为研究确定体外消化液对HepG2细胞的最佳上样浓度，对1.3.2中所得到的薏米、红豆、荞麦、青稞模拟体外消化后的样品进行细胞毒性实验。采用MTT法，将HepG2细胞以8 000 cells/孔的数量接种到96孔板中，每孔100 μL，边缘用PBS填充，铺好板后盖上盖子，十字摇匀，不要旋转摇晃，于CO2培养箱(5% CO2、37 ℃)中培养24 h。将四种杂粮的消化产物用培养液溶解，配制成0～20 mg/mL浓度梯度，换掉96孔板中的培养液，加入样品液，不含样品的培养液视为对照组。每孔100 μL，设3个重复。继续培养24 h后，吸弃上清，每孔加入120 μL MTT(0.1 mg/mL)溶液，继续培养4 h。终止培养，小心吸弃孔内液体，每孔加入100 μL DMSO，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解。酶标仪下检测490 nm下各孔的吸光值。

实验中设凋零孔、对照孔及加药孔。

凋零孔：不含细胞的完全培养基、MTT、DMSO；对照孔：细胞悬液、药物溶剂、MTT、DMSO；加药孔：细胞悬液、不同浓度药物、MTT、DMSO。

1.3.6 HepG2高脂模型的建立及鉴定

将 HepG2细胞接种于6孔板，孵育24 h后取出，设置对照组和模型组；对照组加含10% FBS的DMEM高糖培养基，模型组加含终浓度2.5 mmol/L油酸的8%～10% FBS的DMEM高糖培养基；将6孔板置于37 ℃、5%CO2的培养箱孵育24 h后去除培养液，再充分裂解细胞，得细胞裂解液；将细胞裂解液离心，取上清液测定 TG和LDL-C 含量。当模型组比对照组细胞的TG和LDL-C含量显著提高，同时结合油红染色后在显微镜下能明显观察到细胞内出现脂滴时即HepG2细胞高脂模型构建成功[22]。

用天平称取0.500 0 g 油红干粉(已预先粉碎)，溶于适量异丙醇中，待溶解后，加异丙醇定容至 100 mL，混合均匀。用锡纸遮光保存，此染液为储存液，可 4 ℃长期保存。用时取6 mL，双蒸水稀释至10 mL，混匀，滤纸过滤，现配现用。6孔培养板中培养48 h的细胞，弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻洗2次；加入10%福尔马林溶液固定0.5 h；PBS 洗两次；每孔加入1 mL的油红O稀释液，染色10 min；加入2 mL 75%酒精脱色，洗去多余染料；滴一到两滴于标本上，注意排除气泡，用镊子夹持盖玻片，让盖玻片的一侧先接触甘油，再缓缓放下，用滤纸吸掉边上多余的甘油，显微镜下观察细胞内脂滴，拍照。

1.3.7 降脂活性(TG、LDL)测定

细胞经上述步骤分组培养24 h后分别加入4种模拟消化后杂粮提取物样品，并设置空白对照。继续培养24 h后吸除培养液，PBS轻柔洗涤3次，加入IP细胞裂解液，冰浴裂解细胞30 min，分别按照甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)测试盒操作说明测定细胞内TG及LDL-c含量。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒操作说明测定细胞中蛋白质含量。用蛋白含量校准细胞中TG及LDL-c含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，结果均表示为平均值±标准偏差，应用Origin 8.5进行图形绘制，每组实验重复3次。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 模拟体外消化过程4种杂粮中酚类物质含量的变化

模拟体外消化过程对4种杂粮(薏米、荞麦、青稞、红豆)中的总酚和总黄酮的影响如表1所示。在模拟口腔、胃及小肠消化阶段，4种杂粮中的酚类物质有显著变化。4种原料中，红豆由于其红色种皮中含有大量游离多酚[23]，因此原料中总酚含量最高，并且在整个消化阶段基本保持稳定。而薏米由于其原料中总黄酮含量较低，因此在消化过程中也保持稳定。在薏米、荞麦和青稞中，随着消化过程其中的总酚含量不断增加。其中又以荞麦增加最多，即消化后其中的总酚含量达到(27.78±0.14) mg GAE/100 g，比其在原料中增长了36.18%。该结果说明消化过程对薏米、荞麦和青稞中游离多酚的释放具有显著影响。该结果与Espinosa-Alonso等[24]对浅色种皮谷物在体外消化过程中多酚的释放量趋势呈一致。在荞麦、青稞、红豆中，随着消化过程其中的总黄酮含量不断增加。其中也是以荞麦增加最多，即消化后其中的总黄酮含量从(10.83±0.46) mg RE/100 g增长到(17.11±0.65)mg RE/100 g， 增长率达到57.9%。体外消化过程中总酚和总黄酮含量的升高可能是由于杂粮原料中酚类物质可与淀粉、蛋白质、多糖等天然化合物发生复合，形成稳定且不易释放的复合物[25]。模拟消化过程中由于极端pH值环境、胃蛋白酶和胰酶等作用下使多糖分离，淀粉和蛋白质酶解，有研究报道胃蛋白酶和胰蛋白酶会促使羧基断裂，胰酶中含有的胰脂肪酶能水解酯键，胰淀粉酶具有水解淀粉中糖苷键的功效从而使多酚失去束缚被释放出来，使杂粮在不同消化阶段提取液中酚类物质明显升高[26]。因此，在4种杂粮中荞麦具有最佳的生物利用度，经过体外消化后具有最高的总酚含量及黄酮增长率。

表1 模拟体外消化过程4种杂粮中酚类物质(总酚、总黄酮)释放量变化

注：同行不同字母表示具有显著差异(P<0.05,n=3)。

2.2 模拟体外消化后杂粮提取物细胞毒性测试

为研究确定体外消化液对HepG2细胞的最适作用浓度，采用0、2.5、5、10、20 mg/mL浓度的样品进行MTT实验。结果由图1可知，在样品孵育浓度为2.5 mg/mL时，经4种样品培养24 h后，HepG2细胞均能保持90%活力并无显著差异。此后随着样品浓度升高，四组细胞活力均有不同程度的下降。因此，浓度为2.5 mg/mL的4种杂粮体外消化液均不具有细胞毒性，可作为后续实验的最适作用浓度。

图1 不同浓度的四种消化后杂粮多酚提取物 对HepG2细胞活性影响

2.3 HepG2细胞高脂模型的建立

图2a为对照组即正常HepG2细胞的形态图；图2b为经油酸诱导后HepG2细胞形态，可以观察到细胞中产生了脂滴；图2c和图2d为模型组即高脂HepG2细胞油红染色后的形态图，脂溶性染料可溶于组织和细胞中的脂类，其在脂类中的溶解度远比在溶剂中大，当细胞置入染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质中，使细胞内的脂滴呈橘红色，因此图2表明细胞经油酸处理后已有大量脂质存在[27]。

对照组和模型组HepG2细胞的TG、LDL-C 含量见图3，由图3可以看出，模型组HepG2细胞的TG含量和LDL-C 含量显著高于对照组(正常HepG2细胞)。同时结合显微镜下观察到模型组细胞内出现橘红色脂滴，表明HepG2细胞高脂模型构建成功，模型组细胞即为HepG2细胞高脂模型[22,27]。

注：a油酸诱导前细胞形态；b油酸诱导后细胞形态；c经油红染色后细胞形态；d 经油红染色后细胞三维立体图。
图2 油酸诱导前后HepG2细胞中脂滴聚集形态

图3 经油酸诱导后的HepG2细胞中甘油三酯 及低密度脂蛋白含量变化

2.4 模拟体外消化后杂粮提取物对高脂细胞模型TG、LDL-c水平的影响

如图4所示，高脂模型组和对照组相比，低密度脂蛋白和甘油三酯浓度 (P<0.05)明显增高。随着四种杂粮多酚提取物的添加，薏米、荞麦及红豆干预组中甘油三酯的浓度均有显著下降，其中荞麦干预组与模型组相比甘油三酯浓度下降了1/3，达到(0.156±0.032) mmol/g prot。此外，4种杂粮干预组细胞内低密度脂蛋白含量同样均显著下降，其中荞麦组下降至(0.025±0.005) mmol/g prot，说明其对高脂细胞内低密度脂蛋白的抑制具有良好的预防作用。低密度脂蛋白携带胆固醇到外围组织细胞，可被氧化成氧化性低密度脂蛋白；当氧化修饰后的低密度脂蛋白(OX-LDL)含量过高，胆固醇会积聚在动脉壁，长时间后可能会导致动脉硬化。所以低密度脂蛋白夜被称为“坏的胆固醇”[28]。因此，4种杂粮消化液的作用不仅有利于改善血脂水平而且对于脂代谢异常而引起的心脑血管疾病具有一定的预防作用，其中又以荞麦作用最佳。

注: 图中不同字母表示具有显著差异,P<0.05,n=3。
图4 经2.5 mg/ mL杂粮多酚提取物孵育24 h前后 HepG2细胞中(a)低密度脂蛋白(b)甘油三酯含量

3 结论

本研究建立了体外模拟消化模型研究我国4种常见杂粮(薏米、荞麦、青稞、红豆)的降脂活性。通过口腔-胃-小肠体外消化法来测定杂粮中酚类物质的生物利用度，并构建完整的HepG2高脂细胞模型测定其消化液的降脂活性，初步确定了具有最佳生物利用度和降脂活性的单品。研究结果表明，在4种杂粮中荞麦具有最佳的生物利用度，经过体外消化后具有最高的总酚含量及黄酮增长率。以油酸诱导HepG2建立的高脂细胞中，在2.5 mg/mL浓度的多酚提取物的作用下，薏米、荞麦及红豆干预组中甘油三酯的浓度显著下降，同时4种消化液干预组中细胞内低密度脂蛋白含量均显著下降，其中荞麦干预组与模型组相比甘油三酯浓度下降了1/3，低密度脂蛋白降至0.025 mmol/g prot，表现出最佳的降脂活性。因此，后续将进一步对荞麦消化液中酚类物质的组成及含量进行进一步分析确定，并通过转运模型及代谢组学研究其吸收、转运机制。