硬脑膜厚度及生物力学参数时序性变化在死亡时间推断中的应用

（贵州医科大学法医学院，贵州 贵阳 550004）

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断，即推断死后经历或间隔时间，是法医学实践中需要解决的重要问题之一[1-2]。PMI推断常根据尸体现象、尸体化学、微生物学、昆虫学等变化规律[1，3]。近年来，随着法医生物力学的发展，利用大鼠、家猪等实验动物尸体血管、肠管、肌肉、脑组织等软组织材料的生物力学时序性变化进行PMI推断的研究已有报道[4-7]，但是实验动物与人体相比在组织结构上存在较大差异，其实用性有待进一步研究。

硬脑膜与颅盖骨及颅底骨内面相邻，位于与外界相对隔离的封闭颅腔内，在人死亡后受温度、湿度等外界环境因素影响相对较小[8]，因此人死后硬脑膜的生物力学特性变化更能反映其组织的变化特征，用于PMI推断具有自身优势。此外，与人尸体血管、肌肉组织等同样受环境因素影响较小的组织材料相比，硬脑膜具有其独特的优势：（1）硬脑膜主要由胶原纤维组成，不易受血液中外源性成分如乙醇、毒（药）物等的影响，更能体现组织自身特性[9]；（2）硬脑膜面积较大，取材更方便，试件制作定位更为准确，加之纤维排列和走向更具有规律，不同个体间更具有可比性。

本研究基于硬脑膜自溶、腐败破坏其组织结构以及影响其生物力学性状的原理[5]，研究硬脑膜厚度及生物力学参数的时序性变化，以期用于PMI推断。

1 材料与方法

1.1 样本与分组

收集贵州医科大学法医司法鉴定中心2016年4月—2019年2月受理的法医病理学鉴定案例中人尸体硬脑膜标本，共148例。其中137例为实验组，平均年龄41.3岁；11例为验证组，平均年龄46.5岁。纳入标准：（1）死亡时间在4 d内的尸体；（2）男性，年龄为30～50岁；（3）排除开放性颅脑损伤案例以及尸体检验证实硬脑膜有畸形、破裂、坏死、血管硬化或其他病变等异常硬脑膜标本；（4）案例中死者均经系统尸体解剖检验鉴定。纳入案例中死者的死亡原因主要为心血管疾病猝死和机械性损伤。本研究获得贵州医科大学伦理委员会批准，实验获得死者家属同意并签署知情同意书。

将收集到的实验组硬脑膜样本根据PMI分为6h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h、96h组并取材，将硬脑膜样本置于冰块泡沫盒（-4～4℃）内保存，2h内带回实验室备检（表1）。

1.2 形态及力学参数检测

将符合纳入标准的硬脑膜标本统一于额部距冠状缝1cm、距中线1cm处切取4.0cm×1.0cm的A、B两块试件（图1）。其中，A试件经测量厚度后进行拉伸试验；B试件经10%中性甲醛溶液固定后制作切片，HE染色后在显微镜下观察其形态特征。

表1 硬脑膜样本分组情况Tab.1 Grouping of the dural samples

图1 硬脑膜试件取材部位示意图Fig.1 Schematic diagram of the test specimen of dura

利用带表测厚规（0-10*30型，义乌市开拓五金有限公司）测量硬脑膜A试件厚度，分别测量两端和中间3处，取其均值。利用电子万能材料试验机（KDII-0.2型，深圳市凯强利试验仪器有限公司）检测极限载荷（ultimate load，UL）、最大力变形（maximum force deformation，MFD）、抗拉强度（tensile strength，TS）、弹性模量（elastic modulus，EM）、断裂力（fracture force，FF）等生物力学参数，分别以厚度和各生物力学参数为自变量（x），PMI为因变量（y）建立回归方程，分析各参数与PMI的相关性。

拉伸试验在空调房内进行，室温设置为25℃，湿度维持50%～60%。应用电子万能材料试验机上、下两端夹持硬脑膜试件各1 cm，保持自然平直，标距为20 mm。加载参数设置[5]：（1）采用速度控制，试验速度为20 mm/min，速度方向及传感器方向均为正向；（2）运行条件为预加载力=0.5 N；（3）停机条件为后一个力值小于前一个力值的0.8倍。采用纵向单轴拉伸试验对硬脑膜进行拉伸，试验前对试件进行3次预调，达到稳定的力学状态后开始正式拉伸试验。试验机系统软件自动采集和记录极限载荷、最大力变形、抗拉强度、弹性模量、断裂力等生物力学参数。

1.3 回代检验

取验证组11例的硬脑膜标本，同上述方法处理，测量厚度和生物力学参数，将各参数代入拟合的回归方程计算硬脑膜来源尸体的PMI（预测值），将预测值和实际值进行比较，观察两者间差异有无统计学意义。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，各组数据以表示。将硬脑膜厚度和各生物力学参数（x）分别与PMI（y）进行回归分析，并对回归方程进行单因素方差分析，对回归系数进行t检验。回代检验中，验证组预测值与实际值之间的比较采用配对样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 硬脑膜的组织病理学改变

死后6～96h，随着PMI的延长，硬脑膜从淡红色、有光泽逐渐变为灰色、无光泽，镜下硬脑膜厚度逐渐减小，胶原纤维呈现从排列清晰逐渐变为相互融合，细胞核数量逐渐变少（图2）。

图2 硬脑膜组织随PMI的时序性变化（HE×100）Fig.2 Histopathological changes of the dura at the different PMI

2.2 硬脑膜的厚度变化

随着PMI的延长，硬脑膜平均厚度从（0.49±0.06）mm降至（0.39±0.05）mm，呈时序性下降趋势，与PMI呈明显负相关（r=-0.883，P＜0.05）。以厚度为自变量（x）、PMI为因变量（y）建立的回归方程为y=434.975-906.904x（R2=0.780，F=31.917，P＜0.05）。

2.3 生物力学参数随PMI的变化

死后6～96 h，尸体硬脑膜组织的极限载荷、最大力变形、抗拉强度、弹性模量、断裂力等各项生物力学参数均符合总体方差齐性，服从正态分布。随着PMI的延长，极限载荷从（54.9±5.8）N降至（44.7±13.7）N、弹性模量从（63.6±11.9）MPa降至（38.6±18.6）MPa、断裂力从（37.8±12.5）N降至（16.5±15.3）N，3个参数均呈降低趋势，总体比较差异具有统计学意义（P＜0.05），与PMI呈负相关（r分别为-0.238、-0.320、-0.274，P＜0.05）；抗拉强度从（13.1±4.2）MPa降至（10.6±2.4）MPa，呈降低趋势，但与PMI无相关性（r=-0.157，P=0.097）；最大力变形从（5.9±1.4）cm降至（5.3±0.9）cm，未见明显变化趋势，与PMI无相关性（r=0.018，P=0.848）。

以极限载荷（x1）、弹性模量（x2）、断裂力（x3）为自变量，PMI为因变量（y）的线性回归方程，以及上述变量与PMI拟合所得的多元线性回归方程见表2。

表2 各生物力学参数随PMI变化的回归方程及其统计量Tab.2 Regression equation between biomechanical parameters and PMI in dura after death

2.4 回代检验

通过拟合所得的厚度回归方程计算预测值与实际值最大相差3.07 h，最小相差0.59 h。通过生物力学参数多元线性回归方程计算预测值与实际值最大相差3.46 h，最小相差0.78 h。配对样本t检验结果显示，PMI预测值和实际值之间差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 回代检验结果Tab.3 Return test results （h）

3 讨 论

PMI推断在法医学实践中具有重要作用，尤其对于刑事案件，可以确定犯罪嫌疑人有无作案时间，缩小侦查范围。尽管多种研究方法包括尸体变化、组织病理学变化、死后化学、分子方法、微生物分析、眼部变化、放射照相、昆虫学和其他方法都被用于PMI推断研究[3，10]，但PMI推断的准确性并没有得到显著提高。近年来，有学者[5-7]利用实验动物软组织生物力学变化特性研究PMI推断，取得了一些成果。目前，硬脑膜用于法医学PMI推断方面的研究报道较少[11-13]。因此，本研究选取硬脑膜进行形态学及生物力学参数检测。

本研究中，硬脑膜组织随PMI的延长，颜色从淡红色逐渐变为灰色，光泽度逐渐降低，呈现随自溶、腐败进展而出现的时序性形态学变化趋势[1]，与石学志等[7]报道的猪胸主动脉的形态学观察与PMI呈相关性研究结论一致。硬脑膜主要由胶原纤维组成，且随PMI的延长，纤维逐渐变薄、从清晰逐渐融合，细胞核减少甚至消失，提示硬脑膜试件生物力学参数的时序性变化具有形态学基础。

极限载荷为试件被拉伸全过程中某时间点受力的最大值。弹性模量即单位面积承受的力，为衡量材料产生弹性变形难易程度的指标，其值越小，材料刚度越小。断裂力为试件被拉伸断裂时瞬间受力的值。研究[13]结果表明，极限载荷、弹性模量、断裂力等生物力学性状参数均是直接反映组织生物力学特性的指标，受组织各向异性、黏弹性影响较小，加之本研究截取试件时均取同一部位、同一方向、同一长宽规格的硬脑膜组织，因此，应用极限载荷、弹性模量、断裂力这3个指标可较好地推断PMI。

本研究拉伸试验结果表明，人尸体硬脑膜试件的极限载荷、弹性模量、断裂力等生物力学参数与PMI呈负相关，取已知PMI的硬脑膜标本，按规定处理检材后进行拉伸试验得出生物力学参数，代入建立的硬脑膜各生物力学参数与PMI之间的回归方程进行回代检验，结果发现，通过方程计算的预测值与实际值间差异无统计学意义，表明极限载荷、弹性模量和断裂力这3个指标可用于推断PMI。

本研究发现，抗拉强度与PMI未见相关性，提示该参数不适用于PMI推断。最大力变形与PMI总体亦无明显变化趋势（P＞0.05），因最大力变形=试件末长度-试件初长度（ΔL=L-L0），本研究生物力学试验硬脑膜初长度L0已设置为2.0 cm，试验结束返回后试件末长度L与探头移动距离相关，故最大力变形参数因试验达到极限载荷的距离不同而差异较大，用于推断PMI的可行性较低。

本研究直接选用人尸体硬脑膜标本，避免了动物标本与人体标本实验数据换算问题。FAM等[14]研究了20例成人颅底硬脑膜发现，厚度与硬脑膜年龄呈负相关，与体质量、身高、体重指数等无相关性。同样，ZWIRNER等[15]对73例2～94岁死者硬脑膜拉伸试验证实了上述结论。因此，本研究在选取样本时排除了青少年硬脑膜发育不完全和老年人硬脑膜脆性增加的样本，通过只选用男性硬脑膜样本，排除了年龄因素对硬脑膜厚度的影响，也排除了课题组前期研究发现的男性与女性硬脑膜生物力学参数存在差异的问题，尽可能地保证硬脑膜样本的可比性以及研究结论的科学性和准确性。

本研究也存在一些缺陷：（1）硬脑膜样本的纳入标准虽然设定为人死亡距尸体检验时间为4 d内，尽可能地减小了实验误差，但是各组内案例死亡时间分布有一定差异，可能对实验结果存在影响；（2）尽管在硬脑膜的纳入标准中排除了开放性颅脑损伤以及自身畸形、破裂、坏死和其他硬脑膜病变，但在缺乏现有文献资料条件下依然难以排除其他不同死因、疾病对硬脑膜生物力学参数的影响，尽管这方面的影响可能较微小。

综上所述，人死后6～96h的硬脑膜组织厚度以及极限载荷、弹性模量、断裂力3种生物力学参数可作为PMI推断的新指标。