不同亚型Smads信号蛋白在慢性支气管哮喘小鼠肺组织表达的意义

文莎，佘晖，游锦惠，刘雪君

支气管哮喘是临床上危害人类健康的重要慢性疾病之一，患病年龄段广，从婴幼儿至老年均可发生，与过敏、遗传、环境等多种因素相关[1]，病情反复发作，慢性持续性发展。Smad蛋白家族的名字来源于同源的秀丽隐杆线虫Sma蛋白和黑腹果蝇Mad蛋白[2]。Smads家族蛋白是一类重要的胞内细胞信号传递分子，可以介导转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、激活素(activins)、Nodal蛋白和生长分化因子(growth differentiation factors，GDFs)等细胞因子细胞内信号转导[3]，进一步激活并调控细胞核内基因转录，从而对支气管哮喘及气道重塑的发生、发展产生重要影响。本研究旨在观察慢性支气管哮喘小鼠肺组织内Smads各亚型信号蛋白的表达，探索不同亚型Smads蛋白及其传导的信号通路在慢性支气管哮喘小鼠慢性气道炎症及气道重塑过程中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 (1)动物：健康清洁级雌性6～8周龄BALB/C小鼠18只，体质量(19±1)g[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2013-2018]。(2)主要试剂：卵清白蛋白(ovalbumin，OVA，美国Sigma公司)；氢氧化铝凝胶(美国Sigma公司)；小鼠Smad 1, 3, 4, 5, 7抗体(美国Abcam公司)；β-actin(美国Servicebio公司)。(3)主要仪器：压缩型雾化器(PARIBOYN，德国百瑞公司)；光学显微镜(YS100型，尼康仪器有限公司)；离心机(D3024R，美国DragonLab公司)；组织切片扫描仪及分析软件(Pannoramic MIDI,Quant center，3D HISTECH)；扫描仪(V300，美国Epson公司)；匀浆仪(KZ-II，美国Servicebio公司)；电泳仪(DYCZ-24DN，DYCZ-40D，北京六一仪器厂)。

1.2方法

1.2.1建立动物模型

1.2.1.1建立急性哮喘(acute asthma，AA)组动物模型 参照文献[4]建立AA动物模型。

1.2.1.2建立慢性哮喘(chronic asthma，CA)组动物模型 参照文献[5]及本实验组前期研究建立CA模型的方法，从实验第21天起，采用1% OVA溶液进行雾化吸入激发，每天雾化30 min，持续雾化5 d，连续雾化9周。末次雾化24 h后脱颈处死小鼠，观察到肺脏表面颜色苍白，质硬，进一步行肺组织病理切片苏木素-伊红(H-E)染色，光学显微镜下可见支气管皱襞明显增多，上皮细胞明显增生紊乱，管腔狭窄，气道及血管平滑肌细胞增生等慢性哮喘气道重塑病理变化，动物模型建立成功。

1.2.2分组 随机均分为3组，即正常对照(normal control，NC)组、AA组和CA组。NC组不施加任何处理。

1.2.3肺组织病理切片H-E染色 观察肺脏的大体病理变化，按照肺组织病理切片H-E染色标准步骤，经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色、封片后，光学显微镜下观察肺组织形态结构、炎症细胞浸润、气道上皮损伤及气道周围病理改变。

1.2.4免疫组织化学法检测Smad 1，3，4，5，7在肺组织表达 按照免疫组织化学标准化步骤，将石蜡切片分别经脱蜡、抗原修复、血清封闭、加Smad蛋白一抗、加HRP标记山羊抗兔二抗、加SP、加显色剂、复染、脱水、封片等处理。光学显微镜下观察染色情况(深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性)，并使用Pannoramic组织切片扫描仪及Quant center软件分析方法进行小鼠肺组织内Smad 1，3，4，5，7半定量的组织化学评分(histochemistry score，H-score)。

1.2.5Western-blot法检测Smad 1，3，4，5，7在肺组织表达 粉碎肺组织块，按照Western-blot法规范化操作步骤，检测Smad 1，3，4，5，7在肺组织表达。

2 结 果

2.1肺脏大体情况观察及肺组织病理形态学改变 NC组小鼠肺脏总体呈粉红色，表面光滑、平整，无出血点及水肿，肺组织病理H-E染色后可见支气管上皮细胞完整，黏膜无中断，杯状细胞低平，支气管黏膜下及肺实质血管旁少许淋巴细胞浸润(图1A)。AA组小鼠肺脏总体呈暗红色，表面充血水肿明显，有较多出血点，显微镜下病理可见支气管上皮细胞脱落，黏膜中断，皱襞增加，杯状细胞顶部空泡化明显，肺泡间质水肿，支气管黏膜下及肺实质血管旁可见以嗜酸性粒细胞为主的多种炎症细胞浸润(图1B)。CA组小鼠肺脏颜色、质地不均一，红白交杂，表面不平整，个别肺叶颜色苍白、质硬；进一步行病理学检测，显微镜下可见支气管皱襞明显增多，上皮细胞明显增生紊乱，管腔狭窄，气道及血管平滑肌细胞增生，肺泡破裂，黏膜下、毛细血管旁及肺泡内可见大量炎症细胞浸润(以嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞为主)，且毛细血管旁淋巴细胞弥漫包围(图1C)。

2.2免疫组织化学法观察小鼠肺内Smad 1，3，4，5，7的表达 各组小鼠肺组织内可见蓝染的细胞核背景色，检测NC组Smad 1，3，4，5指标，可见气道上皮细胞、肺泡上皮细胞细胞核不染色，呈阴性反应，细胞浆淡棕色，呈弱阳性反应(图2A，D，G，J)，但Smad 7细胞质和细胞核均可见大面积深棕色颗粒，呈强阳性反应(图2M)；AA组Smad 1，5气道上皮细胞、肺泡上皮细胞及气道黏膜下、毛细血管旁及肺泡内浸润的各类炎症细胞，如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等，细胞核、细胞浆均可见深棕色颗粒，呈强阳性反应(图2B，K)，但CA组Smad 1，5阳性反应较AA组明显减弱，呈中度阳性反应(图2C，L)；AA及CA组的Smad 3，4气道上皮细胞、肺泡上皮细胞及浸润的各类炎症细胞细胞核、细胞浆均可见棕色颗粒，呈中度以上阳性反应(图2E～F，H～I)。CA组与AA组比较，可见更大面积深棕色颗粒，呈强阳性反应(图2F，I)。AA组肺组织内Smad 7较NC组阳性反应明显减弱，呈弱阳性反应(图2N)；但CA组与AA组比较，阳性反应增强，呈中度阳性反应(图2O)。进一步行半定量的组织化学评分，AA组Smad 1，5表达较NC组增加明显，差别有统计学意义(P<0.05)，但CA组较AA组减少明显，差别有统计学意义(P<0.05)；AA组及CA组的Smad 3，4表达均较NC组升高(P<0.05);与AA组比较，CA组肺组织内Smad 3，4表达升高(P<0.05)；AA组肺内Smad 7表达较NC组降低(P<0.05)，但CA组较AA组表达升高(P<0.05)(表1)。

表1 免疫组织化学法检测小鼠肺内Smad 1，3，4，5，7半定量的组织化学评分(H-sore)

Tab 1 Semi-quantitative histochemical scores of Smad 1, 3, 4, 5, 7 in the lungs of mice detected by immunohistochemisty (H-sore)

n=6. NC组：正常对照组；AA组：急性哮喘组；CA组：慢性哮喘组. 与NC组比较，△：P<0.05；与AA组比较，#：P<0.05.

2.3Western-blot法检测Smad 1，3，4，5，7在肺组织表达 AA组小鼠肺组织内Smad 1，5蛋白的相对表达量均较NC组增加，差别有统计学意义(P<0.05)，但CA组较AA组明显降低，且差别有统计学意义(P<0.05)；AA组及CA组的Smad 3，4的相对表达量均较NC组升高，差别有统计学意义(P<0.05)，且CA组比AA组表达量进一步升高(P<0.05)。AA组Smad 7的蛋白表达量较NC组降低明显，差别有统计学意义(P<0.05)，但CA组比AA组表达量进一步升高，差别有统计学意义(P<0.05)(表2)。

3 讨 论

哮喘是一种与变应源相关的、持续存在的慢性变应性气道炎症性疾病[6]，参与炎症反应的各种生长因子如TGF-β，BMP等通过募集细胞内细胞信号传递分子Smads蛋白，进行核转位，转运入核激活靶向基因，激活、募集嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞，导致哮喘变应性炎症和气道重塑[7]。Smad也被认为参与了CDKN2B基因编码p15的表达控制，CDKN1A基因编码p21，c-myc，ID1和ATF3的表达[8]。

表2 Western-blot法检测Smad 1，3，4，5，7的相对表达量

n=6. NC组：正常对照组；AA组：急性哮喘组；CA组：慢性哮喘组. 与NC组比较，△:P<0.05；与AA组比较，#:P<0.05.

Smads蛋白成员主要包括Smad 1-8，可以分为3个亚家族：受体激活的Smad(Smad proteins regulated by the receptor, R-Smads)、协同作用的Smad(co-mediating Smad，Co-Smad)、起抑制作用的Smad(inhibitory Smad，I-Smad)[9]。R-Smads主要包括Smad 1，2，3，5，8，其负责将信号传递到细胞核，在结构上，均由仅连接结构不同的MH结构域(与果蝇蛋白Mad同源)组成，N-端区域(即MH1)结合DNA，C-端区域(即MH2)负责核转录启动及调控。Co-Smad目前仅发现Smad 4蛋白，其可以与磷酸化R-SMAD蛋白形成R-SMAD-Co-SMAD复合物，进入细胞核，通过MH1结合TGF-β1、activins和BMP基因的CAGAC序列(SMAD-binding domain,SBD),对信号做出反应，以激活转录[10]。信号传递过程完成后，激活的R-Smad蛋白在特异磷酸酶作用下去磷酸化，同时，Smad 7诱导参与的已活化蛋白泛素化蛋白酶解和溶酶体降解。

目前，TGF-β1/Smads信号通路与支气管哮喘、气道重塑之间的关系逐渐得到大家的认识。TGF-β1可与细胞膜表面的TGF-β受体(TGF-β receptors，TGFR)结合，募集细胞质内的R-Smads即Smad 2，3，使其磷酸化而激活，进一步与Co-Smad协同作用进行核转位，转运入核激活靶向基因，激活、募集嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞，导致哮喘变应性炎症[7]。本研究中，笔者观察到AA组肺组织内Smad 3，4表达明显升高，考虑TGF-β1/Smads信号通路在急性哮喘小鼠肺组织内活化激活。

同时，TGF-β1诱导成纤维细胞的趋化，刺激其增殖，增加成纤维细胞、纤连蛋白、蛋白聚糖、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成以及抑制胶原酶和基质金属蛋白酶的基因表达，导致气道重塑[11]。另外，TGF-β1还可促进气道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)细胞增殖[12]。TGF-β1通过结合跨膜蛋白丝氨酸苏氨酸激酶受体，磷酸化激活下游Smad 2，3信号蛋白，与Co-Smad协同作用进行核转位进入细胞核发挥作用。Smad 2，3可以直接与DNA相结合而发挥作用，也可以同其他因子如P300/CBP、MSC1等协同激活DNA上其他因子转录，如激活MyoD、AR等的表达，而ski、HDACs等对Smad 2，3信号系统起负调节作用[8]。本研究中，笔者也观察到CA组肺组织内Smad 3，4表达较AA组明显升高，考虑慢性哮喘肺组织内TGF-β1/Smads信号通路极有可能在急性哮喘基础上进一步活化。

BMPs在调控胚胎肺及支气管发育过程中发挥重要作用，其可能在维持呼吸道稳态中发挥着重要作用[13]。Smad 1，5，8参与BMPs信号传递，可被ActR-I，BMPR-IA或BMPR-IB磷酸化而激活。Rosendahl等通过构建过敏性气道炎症实验模型，研究了BMP蛋白水平的变化及Smad蛋白的激活[14]，发现与正常上皮细胞对比，炎症化的支气管上皮细胞和其他肺泡细胞表达磷酸化Smad 1(pSmad 1/5)，提示BMP/Smad信号通路的激活。在本研究中，笔者也观察到AA组肺组织内Smad 1，5表达升高，考虑为急性哮喘时BMP/Smad信号通路被激活。但在慢性持续性过敏原刺激下的CA组却观察到Smad 1，5表达降低，其具体的机制及作用有待进一步研究。

Smad 7属于I-Smad，结构与R-Smads完全不同，I-Smad只有C-端结构域，而没有N-端结构域[9]。Smad 7可以抑制Smad 1，2，3，5，8信号通路，也可以通过诱导TGFR-Ⅱ受体降解，抑制R-Smad磷酸化，影响R-Smad-Co-Smad复合物的形成。I-Smad蛋白与R-Smad相互竞争，阻止其与受体或Smad 4结合，从而阻断TGF-β1、BMP信号传递[15]。此外，Smad 7还参与SMURF2泛素连接酶向TGF-β1受体的募集，导致TGFR-I-TGFR-II复合物、Smad 7和Smad 2蛋白酶解和溶酶体降解[16]。本研究发现，AA组小鼠肺组织内Smad 7蛋白表达明显降低，有助于TGF-β1信号通路的活化；而CA组肺组织内Smad 7蛋白高表达，是否与机体自身负反馈调节反应有关，有待进一步研究。