ADRB1基因多态性与结直肠癌患者疼痛敏感度及腹腔镜术后芬太尼镇痛效果的关联

马敏明，李盈科，袁红斌

结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，占所有癌症的9%左右，是全球第四大癌症致死原因[1-2]。目前，结直肠癌最广泛应用的临床治疗方法是腹腔镜根治术，但其麻醉质量是当前医学界面临的一大挑战。考虑到镇痛剂量在个体之间可能存在显著差异，个体间疼痛和镇痛敏感性的差异可能会阻碍有效的疼痛治疗[3]，探寻结直肠癌患者疼痛敏感度以及手术镇痛效果的影响因素，对于提高麻醉质量以及有效的疼痛治疗起着至关重要的作用。研究指出，除环境因素外，遗传因素是疼痛敏感度及镇痛剂效果个体间差异的重要影响因素[4]。而作为一种常见的基因遗传学现象，基因多态性与各种临床特征的关联(包括疼痛敏感度等)，正逐渐为人所知[5-6]。beta肾上腺素受体1(ADRB1)能够介导激素肾上腺素和神经递质去肾上腺素的生理作用，其基因多态性已在接受整容手术的日本人群中被证实与疼痛敏感度和镇痛剂效果相关[4]。然而，在接受腹腔镜根治术的中国结直肠癌患者中，ADRB1基因多态性是否影响疼痛敏感度及术后镇痛效果仍未知。本研究旨在探索 ADRB1基因多态性与接受腹腔镜根治术的结直肠癌患者疼痛敏感度及术后芬太尼镇痛效果的关联，报道如下。

1 对象与方法

1.1对象 本研究为前瞻性队列研究，连续纳入2014年1-12月接受腹腔镜根治术治疗的结直肠癌患者191例，男性107例(56.0%)，女性84例(44.0%)，年龄(58.8±8.6)岁(29～75岁)，体质量(60.4±10.4)kg (38.8～96.7 kg)；吸烟者79例(41.4%)，饮酒者100例(52.4%)，合并高血压病者121例(63.4%)、糖尿病者24例(12.6%)、高尿酸血症者69例(36.1%)；ASA Ⅰ级和Ⅱ级患者分别有65例(34.0%)和126例(66.0%)；病理高分化、中分化和低分化患者分别有27例(14.1%)，138例(72.3%)和26例(13.6%)，最大肿瘤直径为(4.7±1.2)cm (2.0～7.5 cm)，肿瘤为隆起型、浸润型、溃疡型和浸润溃疡型者分别有65例(34.0%)，31例(16.2%)，36例(18.8%)和59例(30.9%)，肿瘤浸润至黏膜下层、肌层、浆膜或浆膜外患者分别有5例(2.6%)，19例(9.9%)和167例(87.4%)，TNM分期为Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期者分别有24例(12.6%)，84例(44.0%)和83例(43.5%)。纳入标准：(1)根据临床、影像及病理特征诊断为原发结直肠癌的患者；(2)年龄为18～75岁；(3)ASA分级为Ⅰ～Ⅱ级；(4)准备接受腹腔镜根治术治疗。排除标准：(1)既往有其他实体恶性肿瘤史或者血液恶性疾病史患者；(2)既往有结直肠手术史患者；(3)既往有系统性免疫疾病或术前服用免疫抑制药物的患者；(4)伴有中重度肝肾功能不全、严重心血管疾病或神经系统疾病的患者；(5)怀孕或妊娠期妇女。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1基因多态性检测 采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(restriction fragment length polymorphic polymerase chain reaction, PCR-RFLP)检测ADRB1 rs1801252 A145G和ADRB1 rs1801253 G1165C的基因多态性。术前采集患者全血样本，按照全血基因组提取试剂盒(美国Sigma公司)提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，采用高保真PCR聚合酶(日本TOYOBO公司)于PCR仪(美国ABI公司)上进行扩增(94 ℃变性3 min，94 ℃变性30 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循环35次，最后72 ℃延伸5 min)。DNA产物纯化后，取1 μg，加入1 μL限制性内切酶(日本TAKARA公司)，依照说明书加入反应缓冲液配制成20 μL，于37 ℃温育2 h。配制1.2%琼脂糖凝胶(美国Sigma公司)，取10 μL酶切产物于琼脂糖凝胶上140 V电泳20 min。最后在凝胶成像系统(BIO-RAD)下观察电泳结果。引物如下：

ADRB1 rs1801252：

F：GACCTCCCTCTGCGCACCAC

R：CTGAGGTCCACAGCTCGCAGA

ADRB1 rs1801253：

F：ACGCTGGGCATCATCATGGGC

R：ACATCGTCGTCGTCGTCGTCC

1.2.2疼痛敏感评估 (1)将常用手放入冰水中，淹过腕关节；(2)将手保持浸入冰水中，一旦患者感觉到疼痛，立刻将手抽出水面；(3)为避免组织损伤，达到150 s患者依然未感觉到疼痛，需要立刻将手抽出；(4)计算患者将手放入水中至抽出的时间，作为疼痛敏感评估(latency to pain perception, PPL)。

1.2.3术前准备 (1)术前30 min肌内注射阿托品0.5 mg和苯巴比妥0.1 g；(2)进入手术室后监测无创血压、心电图、脉搏氧饱和度；(3)右侧颈内静脉、左侧桡动脉穿刺置管，分别进行输液及中心静脉压和有创血压监测。

1.2.4全静脉麻醉 (1)所有患者均采取全静脉麻醉加气管插管，机械通气；(2)麻醉诱导：采用瑞芬太尼1 μg/kg，丙泊酚2 mg/kg，顺式阿曲库铵0.2 mg/kg依次静脉注射；(3)麻醉维持：瑞芬太尼、丙泊酚持续输注，顺式阿曲库铵间断注射；(4)监控麻醉深度，维持呼气末二氧化碳分压于35～45 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，维持脑电双频指数(bispectralindex, BIS)于45～55；(5)术中乳酸钠林格液及琥珀酰明胶按照1∶1的比例以10～15 mL·kg-1·h-1持续输注。

1.2.5术后患者自控镇痛(patient controlled analgesia, PCA) 手术结束后，停用瑞芬太尼前以芬太尼0.1 mg联合甲磺酸托烷司琼6 mg静脉注射，作为镇痛负荷量。于左侧三角肌处皮下置入静脉留置针，接入PCA泵(100 mL，含芬太尼1.0 mg及甲磺酸托烷司琼6 mg)，维持剂量1.0 mL/h，锁定时间15 min，单次给药1.0 mL。

1.2.6术后48 h资料收集和长期随访 记录患者48 h内追加镇痛药次数，追加芬太尼剂量(自控释放次数)，48 h芬太尼总用量，2，6，12，24，48 h患者疼痛(visual analogue scale, VAS)评分,患者整体评估(patient global assessment, PGA)评分以及患者恶心和呕吐情况(postoperative nausea and vomiting, PONV)。术后第一年每3～6月随访1次，之后每6～12月随访1次，采用电话或门诊随访，记录患者的生存情况，计算其总体生存期(overall survival, OS)(定义为患者手术时间至患者死亡时间)。最后随访日期为2017年11月30日，随访时间为39.7月(3.0～47.0月)。

2 结 果

2.1ADRB1基因多态性与结直肠癌患者临床病理特征的关联 191例中，ADRB1 rs1801252 AA，AG，GG携带者分别为132例(69.1%)，55例(28.8%)和4例(2.1%)(表1)；ADRB1 rs1801252不同基因表型携带者临床病理特征差别无统计学意义(均为P>0.05)。ADRB1 rs1801253 CC，CG，GG携带者分别为120例(62.8%)，59例(30.9%)和12例(6.3%)；ADRB1 rs1801253不同基因表型携带者肿瘤浸润程度差别具有统计学意义(P=0.048)，以CG携带者肿瘤浸润程度最高，CC携带者次之，GG携带者最低。然而，ADRB1 rs1801253不同基因表型携带者其他临床病理特征差别并无统计学意义(P>0.05)。

表1 ADRB1基因多态性与患者临床病理特征的关联

表中数据除年龄、体质量及最大肿瘤直径，余数据均为n(%).

2.2ADRB1基因多态性与结直肠癌患者PPL的关联 结直肠癌患者中，ADRB1 rs1801252 AA,AG,GG携带者PPL均值分别为(7.3±2.6)，(21.1±22.7)和(30.1±25.4)s，即AA携带者PPL均值最低，AG携带者次之，GG携带者最高，不同基因表型携带者PPL均值差别具有统计学意义(P=0.020)。ADRB1 rs1801253 CC,CG,GG携带者PPL均值分别为(26.5±23.3)，(29.6±29.1)和(19.3±14.8)s，不同基因表型携带者PPL均值差别不具有统计学意义(P=0.395)。以上数据显示ADRB1 rs1801252基因多态性与患者疼痛敏感度相关，而ADRB1 rs1801253基因多态性与患者疼痛敏感度无明显关联。进一步的PPL影响因素的单因素及多因素分析显示，ADRB1 rs1801252基因多态性为PPL的独立预测因素(表2)。

表2 PPL影响因素的单因素和多因素分析

数据以P值、R2(决定系数)、Beta(标准化系数)、B(未标准化系数)和95%CI(置信区间)形式进行展示. PPL：疼痛敏感度.

2.3ADRB1基因多态性与结直肠癌患者术中麻醉指标及术后48 h内镇痛芬太尼用量的关联 ADRB1 rs1801252不同基因表型携带者术中芬太尼追加次数(P<0.001)、追加剂量(P<0.001)及术后48 h芬太尼使用量(P<0.001)差别均具有统计学意义，其中AA携带者术中芬太尼追加次数、追加剂量及术后48 h芬太尼使用量最高，AG携带者次之，GG携带者最低(表3)。但ADRB1 rs1801252不同基因表型携带者的手术时间(P=0.250)、输液量(P=0.097)、丙泊酚使用量(P=0.555)、瑞芬太尼使用量(P=0.373)均无明显差异。此外，ADRB1 rs1801253不同基因表型携带者术中麻醉指标及术后48 h内芬太尼使用量差别均无统计学意义(均为P>0.05)。48 h内芬太尼使用量影响因素的单因素及多因素分析也显示，ADRB1 rs1801252基因多态性为48 h芬太尼使用量的独立预测因素(表4)。以上数据表明，ADRB1 rs1801252基因多态性与芬太尼用量效果相关，而ADRB1 rs1801253基因多态性与芬太尼用量无明显关联。

2.4ADRB1多态性与结直肠癌患者术后不同时间点的疼痛VAS评分、PGA评分和PONV的关联 ADRB1 rs1801252不同基因表型携带者术后不同时间点的疼痛VAS评分、PGA评分和PONV差别均无统计学意义(均为P>0.05，表5)。ADRB1 rs1801253不同基因表型携带者术后6 h PONV(P=0.046)及术后24 h PONV(P=0.022)差别具有统计学意义，其中GG携带者术后6 h PONV及术后24 h PONV最高，CC携带者次之，CG携带者最低。然而，ADRB1 rs1801253不同基因表型携带者其余时间点疼痛VAS评分、PGA评分和PONV均无明显差别(均为P>0.05)。以上数据提示，ADRB1 rs1801252基因多态性与术后疼痛、PGA及PONV均无明显关联；ADRB1 rs1801253基因多态性与术后PONV发生率相关，但与术后疼痛、PGA无明显关联。结合芬太尼用量及术后疼痛，ADRB1 rs1801252基因多态性与术后芬太尼镇痛效果相关，而ADRB1 rs1801253基因多态性与术后芬太尼镇痛效果不相关。

表3 ADRB1基因多态性与术中麻醉指标及术后48 h内镇痛芬太尼用量的关联

Tab 3 The correlation of ADRB1 polymorphism with intraoperative anesthetic indexes and fentanyl dosage within 48 h post operation

麻醉指标rs1801252AA(n=132)AG(n=55)GG(n=4)P值rs1801253CC(n=120)CG(n=59)GG(n=12)P值t手术/min169.8±5.4178.8±22.7182.7±19.20.250181.1±21.8183.0±17.0171.9±19.30.233V输液量/mL2 404.5±165.02 434.4±154.62 481.8±144.10.0972 458.2±151.42 491.8±143.22 424.4±138.90.219m丙泊酚/mg1 307.0±270.31 224.3±233.21 205.2±192.20.5551 218.4±220.71 197.8±179.51 231.5±180.70.780m瑞芬太尼/mg2.7±0.72.5±0.52.4±0.40.3732.4±0.52.4±0.42.5±0.40.819n芬太尼追加32.8±12.815.2±11.510.5±8.5<0.00111.9±10.012.1±9.718.0±13.10.134m芬太尼追加剂量/g327.5±127.6151.5±115.2105.1±85.3<0.001118.5±100.2120.9±97.2180.0±130.70.134m48 h芬太尼/g807.5±127.6631.5±115.2585.1±85.3<0.001598.5±100.2600.9±97.2660.0±130.70.134

表4 48 h芬太尼使用量影响因素的单因素和多因素分析

数据以P值、R2(决定系数)、Beta(标准化系数)、B(未标准化系数)和95%CI(置信区间)形式进行展示.

2.5ADRB1多态性与结直肠癌患者OS的关联

ADRB1 rs1801252不同基因表型携带者OS差别无统计学意义(P=0.839，图1A)，且ADRB1 rs1801253不同基因表型携带者OS差别也不具有统计学意义(P=0.413，图1B)。

表5 ADRB1多态性与术后不同时间点的疼痛VAS评分、PGA评分和PONV的关联

VAS：视觉模拟评分；PGA：患者总体评估；PONV：术后恶心和呕吐. 表中数据PONV为n(%).

3 讨 论

本研究旨在探索ADRB1基因多态性与接受腹腔镜根治术的结直肠癌患者疼痛敏感度及术后芬太尼镇痛效果的关联。研究发现：(1)ADRB1 rs1801252基因多态性与患者疼痛敏感度相关，但ADRB1 rs1801253基因多态性与患者疼痛敏感度无明显关联；(2)ADRB1 rs1801252基因多态性与术后芬太尼镇痛效果相关，但ADRB1 rs1801253基因多态性与术后芬太尼镇痛效果无明显关联；(3)ADRB1 rs1801252和ADRB1 rs1801253基因多态性均与患者的生存期无明显关联。

ADRB1是一种关键性的细胞表面信号蛋白，能够介导交感神经系统的作用并参与疼痛机制，影响镇痛剂效果[7-8]。ADRB1与吗啡镇痛受体以及阿片受体系统相关，例如，ADRB1受体拮抗剂，如普萘洛尔和阿普洛尔，可以刺激G蛋白通路从而减少脊椎疼痛信号的传输[9]。在动物实验中，ADRB1还与疼痛的消极情感成分相关，例如，在大鼠终纹核注射ADRB1拮抗剂可以降低因阿片类药物戒断引起的条件性位置厌恶[10]。据此可以推测，ADRB1可能影响人类对于疼痛的敏感度，进而可能影响镇痛类药物的效果。ADRB1基因的多态性主要位于该基因的编码区域，ADRB1 rs1801252 A145G导致了在细胞外N端49位的氨基酸从丝氨酸到甘氨酸的取代，而该位置为甘氨酸的ADRB1有更高的激动剂亲和力以及环腺苷酸活动性[7]。另一基因多态性ADRB1 rs1801253 G1165C导致了细胞内C端389位氨基酸从甘氨酸到精氨酸的取代，并且提高了腺苷酸环化酶活性[8]。目前，已有研究报道了ADRB1基因多态性与疼痛敏感度和镇痛剂效果的关联，比如在接受整容手术的日本患者中，女性患者ADRB1 rs1801252和ADRB1 rs1801253的G等位基因均与PPL值、芬太尼镇痛效果正相关，且所有患者ADRB1 rs1801252和ADRB1 rs1801253 G等位基因均与术后24 h疼痛VAS评分正相关[4]。另一项在中国人群中进行的研究表明，ADRB1 rs1801252 G等位基因与PPL值及芬太尼镇痛效果均呈正相关，且单倍体分析显示，ADRB1 rs1801252和ADRB1 rs1801253 G等位基因均与疼痛VAS评分无明显关联[3]。以上研究一定程度上揭示了ADRB1基因的多态性与疼痛敏感度及镇痛剂效果的关联。本研究结果显示，在接受腹腔镜根治术的结直肠患者中，ADRB1 rs1801252基因多态性与患者疼痛敏感度相关，以AA携带者疼痛敏感度最高，AG携带者次之，GG携带者最低；ADRB1 rs1801252基因多态性与术后芬太尼镇痛效果相关，以AA携带者术后芬太尼镇痛效果最差，AG携带者次之，GG携带者最好。而ADRB1 rs1801253基因多态性与患者疼痛敏感度及术后芬太尼镇痛效果均无明显关联。原因可能是ADRB1 rs1801252 G等位基因代表了甘氨酸的优势存在，且已有研究表明，细胞外N端49位为甘氨酸的ADRB1受体内化和脱敏高于该位置为丝氨酸的ADRB1，因此信号强度更低[7,11]。另外，ADRB1 rs1801252 G等位基因携带者ADRB1的下调可能更多，导致疼痛减轻[4]。因此，ADRB1 rs1801252 G等位基因携带者疼痛敏感度更低，术后芬太尼镇痛效果在该组患者中更好。此外，笔者还发现，ADRB1 rs1801252和rs1801253基因多态性与患者的生存期无明显关联。这可能归因于，ADRB1基因多态性的作用可能仅局限于对疼痛敏感度及芬太尼镇痛效果，而对于患者长期生存并没有影响。

本研究尚存在一些缺陷。首先，纳入的样本量相对较小，因而ADRB1 rs1801252和ADRB1 rs1801253 GG携带者数量也较少，可能会影响统计效能；其次，由于该研究为单中心研究，患者的纳入存在地域偏倚。另外，ADRB1基因多态性影响疼痛敏感度与芬太尼镇痛效果的分子学机制并没有纳入研究。因此，有必要进行基于多中心以及更大样本量的研究来进一步验证本研究的结果。最后，本研究仅纳入ADRB1基因多态性以研究其与接受腹腔镜根治术的结直肠癌患者疼痛敏感度及术后芬太尼镇痛效果的关联，未考虑其他基因多态性联合作用及与各种临床特征的关联。

综上所述，ADRB1 rs1801252基因多态性与接受腹腔镜根治术的结直肠癌患者疼痛敏感度以及芬太尼镇痛效果相关，为更好地实现个体化疼痛治疗提供了有价值的信息。