长链非编码RNA牛磺酸上调基因1表达水平在Ⅰ～Ⅱ期宫颈癌诊断和预后中的作用

夏 艳，金志军

宫颈癌(cervical cancer, CC)是全球女性第三大常见肿瘤[1]。目前CC的治疗方法有外科手术、化疗和放疗等，但是由于肿瘤细胞耐药、疾病复发等，患者的预后欠佳，5年生存率约为40%[2-3]。因此，开发新的诊断和预后标志物以提高患者长期生存获益是非常必要的。长链非编码RNAs (long non-coding RNAs, lncRNAs)是一类长度>200个核苷酸、不具有编码蛋白质功能的RNA分子[4]，其在多种疾病中发挥重要功能，包括表观遗传调控和转录以及转录后调控等[5]。最近，越来越多的研究表明，lncRNA表达失调与肿瘤的发生和进展有关[6-10]。在所有与癌症相关的lncRNAs中，牛磺酸上调基因1(taurine upregulated gene 1, TUG1)是近年发现的lncRNA，它参与调控多种肿瘤细胞的增殖和凋亡[6-7,11-14]。lncRNA TUG1在胆管癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中高表达，并且与患者的预后相关[7,15-16]。本研究旨在评估CC患者癌组织lncRNA TUG1的表达水平与CC诊断及预后的关系。

1 对象与方法

1.1对象 前瞻性队列研究连续纳入2014年1月—2015年12月接受手术治疗的CC患者137例。入组标准：(1)经临床和病理检查确诊为CC患者；(2)年龄≥18周岁；(3)国际妇产科联盟(international federation of gynecology and obstetrics, FIGO)分期为Ⅰ～Ⅱ期；(4)准备接受手术切除，且未行术前新辅助化疗或放疗。排除标准：(1)严重感染或中重度肝肾功能异常患者；(2)有性传播疾病或急性生殖系统炎症患者；(3)有其他恶性肿瘤史患者；(4)妊娠期或者哺乳期妇女；(5)研究者评估难以定期随访的患者。本研究已获得第二军医大学附属长征医院伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。

1.2信息采集和随访 137例确诊为CC的患者中，年龄<45岁44例(32.1%)，年龄≥45岁93例(67.9%)；肿瘤大小<4 cm 59例(43.1%)，≥4 cm 78例(56.9%)；组织学类型为鳞癌的患者82例(59.9%)，腺癌55例(40.1%)。FIGO分期为ⅠA期、ⅠB期和ⅡA期的患者分别为27例(19.7%)，73例(53.3%)和37例(27.0%)；淋巴结转移阴性和阳性分别为69例(50.4%)和68例(49.6%)；宫颈基层浸润深度<2/3和≥2/3的患者分别为70例(51.1%)和67例(48.9%)。FIGO分期由2名副高以上职称的妇科医师评定。18例行筋膜外子宫切除术，9例行改良根治性子宫切除术，110例行根治性子宫切除术。62例淋巴结阴性、切缘阴性、宫旁组织阴性，术后定期询问病史和体检，未进行辅助治疗；75例手术发现盆腔淋巴结阳性和(或)手术切缘阳性和(或)宫旁组织阳性，术后28例进行盆腔放疗、31例行盆腔放疗+顺铂单药同步化疗、16例行盆腔放疗+顺铂联合5-氟尿嘧啶的同步化疗。手术后根据患者年龄、病理类型和分期等因素综合考虑选择基于顺铂的同步放化疗。术后第1年，每1～3月随访1次，随后每3～9月随访1次，随访截止日期为2017年6月，中位随访时间为23月(7～42月)。截止2017年6月，137例中共有83例死亡，其中78例因宫颈癌死亡，5例因其他原因死亡。137例中共有59例为终检值(包括5例因其他原因导致的死亡患者和54例随访截止时仍未死亡的患者)。总体生存期(overall survival，OS)定义为患者从诊断之日到任何原因导致死亡的时间。

1.3标本采集 所有患者于手术中切除宫颈癌组织，并于距癌组织边缘2.5 cm处取配对的癌旁组织，立即以生理盐水冲洗，后放入液氮中储藏，以备后期检测使用。

1.4定量聚合酶链式反应 采用TRizol法(美国Invitrogen公司)提取CC患者癌组织和癌旁组织的总RNA，并用逆转录试剂盒(日本TOYOBO公司)将总RNA逆转录成cDNA 待用。以U6作为lncRNA TUG1内参，严格按照SYBR Green Ⅰ 荧光定量PCR试剂盒(美国KAPA公司)操作说明进行qPCR反应(95 ℃ 5 min→40个循环95 ℃ 5 s→60 ℃ 30 s)，采用2-△△ct方法计算lncRNA TUG1的相对表达量。 lncRNA TUG1和U6引物采用Primer Premier 5.0 (Premier, Framingham, USA)设计。引物信息如下：

lncRNA TUG1:

Forward：5’-TAGGAGTGGATGTGTTCTGTAGCA-3’

Reverse：5’-TGGTCGTGGAATATGGTCAATGAG-3’

U6：

Forward：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’

Reverse：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’

1.5统计学处理 采用SPSS 22.0软件和GraphPad prism 5.01软件进行统计分析。数据展现形式为频率(百分比)或中位值(1/4～3/4分位值)。采用Wilcoxon符号秩和检验比较lncRNA TUG1在癌组织和配对的癌旁组织中的表达差异，采用Wilcoxon秩和检验比较不同亚组间lncRNA TUGI的表达差异。采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分析lncRNA TUG1表达水平和OS的关联。采用单元、多元Cox比例风险模型分析CC患者的癌组织lncRNA TUG1表达量以及临床病理特征对患者OS的预测作用。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1lncRNA TUG1在CC癌组织和配对的癌旁组织中的表达水平 CC癌组织lncRNA TUG1相对表达量[中位值：2.436(四分位间距：1.278～4.243)]显著高于配对的癌旁组织[中位值：1.197(四分位间距：0.516～1.947)](P<0.001，图1)。

2.2癌组织lncRNA TUG1表达水平与患者临床病理特征的关联 采用Wilcoxon秩和检验分析癌组织lncRNA TUG1表达水平在CC患者不同临床病理特征亚组中的差异，结果显示癌组织lncRNA TUG1表达水平与FIGO分期(P=0.023)呈正相关，而与其他临床病理特征无关(表1)。

2.3癌组织lncRNA TUG1表达水平与CC患者OS的关联 按照lncRNA TUG1在癌组织中表达水平的中位值2.436将患者分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier曲线和Log Rank检验显示，癌组织lncRNA TUG1高表达患者的累积OS(OS中位值20.0月，95%CI：16.2～23.8月)显著低于癌组织lncRNA TUG1低表达的患者(OS中位值36.0月，95%CI：31.0～41.1月)(P<0.001，图2A)。在78例因CC死亡的患者中，癌组织lncRNA TUG1高表达患者的累积OS(OS中位值22.0月，95%CI：16.0～28.0月)显著低于癌组织lncRNA TUG1低表达的患者(OS中位值36.0月，95%CI：31.0～41.0月)(P<0.001，图2B)。

2.4影响OS的因素 采用多元Cox比例风险模型分析CC患者的癌组织lncRNA TUG1表达量及

表1 癌组织lncRNA TUG1表达水平与宫颈癌患者临床病理特征的关联

Tab 1 Correlation of lncRNA TUG1 expression in tumor tissue and clinicopathological features in CC patients

参 数癌组织lncRNA TUG1表达水平高表达低表达P值n6968年龄/岁0.128 <4518(40.9)26(59.1) ≥4551(54.8)42(45.2)d肿瘤/cm0.349 <427(45.8)32(54.2) ≥442(53.8)36(46.2)组织学类型0.250 鳞癌38(46.3)44(53.7) 腺癌31(56.4)24(43.6)FIGO分期0.023 ⅠA期11(40.7)16(59.3) ⅠB期33(45.2)40(54.8) ⅡA期25(67.6)12(32.4)淋巴结转移0.200 阴性31(44.9)38(55.1) 阳性38(55.9)30(44.1)宫颈肌层浸润深度0.348 <2/338(54.3)32(45.7) ≥2/331(46.3)36(53.7)

CC:宫颈癌；lncRNA：长链非编码RNA； TUG1：牛磺酸上调基因1; FIGO分期:国际妇产科联盟分期.

临床病理特征对患者OS的预测作用，发现癌组织lncRNA TUG1高表达是CC患者OS较差的独立预测因素(P=0.001)。此外，肿瘤≥4 cm(P<0.001)、FIGO Ⅱ期(P<0.001)、淋巴结转移阳性(P<0.001)和宫颈基层浸润深度≥2/3(P=0.002)也是CC患者OS较差的独立预测因素。

表2 影响OS因素多元Cox比例风险模型分析

Tab 2 Analysis of factors affecting OS by Cox’s proportional hazard regression

项 目多元Cox比例风险模型P值HR95% CI低高癌组织lncRNA TUG1高表达0.001 2.417 1.436 4.067 年龄≥45岁0.164 1.464 0.856 2.504 d肿瘤≥4 cm<0.001 2.491 1.524 4.072 组织学类型(腺癌vs鳞癌)0.584 0.878 0.551 1.398 FIGO分期(Ⅱ vs Ⅰ)<0.001 2.391 1.469 3.891 淋巴结转移(阳性vs阴性)<0.001 2.607 1.566 4.340 宫颈肌层浸润深度≥2/30.002 2.175 1.344 3.520 手术方式 筋膜外全子宫切除术△---- 改良根治性子宫切除术0.186 2.067 0.705 6.058 根治性子宫切除术0.212 1.668 0.747 3.722 辅助治疗#(有 vs无)0.547 0.851 0.504 1.438

CC:宫颈癌；lncRNA：长链非编码RNA； TUG1：牛磺酸上调基因1; FIGO分期: 国际妇产科联盟分期. △:手术方式以筋膜外全子宫切除术为参考，其他手术方式均与筋膜外全子宫切除术进行对比. #:辅助治疗包括：盆腔放疗+顺铂(或顺铂+5-氟尿嘧啶).

3 讨 论

本研究发现：(1)CC患者的癌组织lncRNA TUG1表达水平高于配对的癌旁组织；(2)CC癌组织lncRNA TUG1表达水平与FIGO分期和淋巴结转移正相关；(3)癌组织lncRNA TUG1高表达的患者具有较差的OS，且lncRNA TUG1高表达是CC患者OS较差的独立预测因素。此外，肿瘤≥4 cm、FIGO Ⅱ分期、淋巴结转移阳性和宫颈基层浸润深度≥2/3是CC患者OS较差的独立危险因素。

lncRNA TUG1是一个长约7.1 kb的lncRNA，位于染色体22q12。研究发现，lncRNA TUG1可以促进肿瘤的发生和发展，且多种肿瘤的lncRNA TUG1的表达水平与临床病理特征相关。Wang等发现，与肾透明细胞癌的癌旁组织相比，癌组织的lncRNA TUG1表达水平显著升高，且lncRNA TUG1表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移和远端转移显著正相关[17]。研究发现，癌组织中lncRNA TUG1的表达水平高于癌旁组织，且lncRNA TUG1表达水平与肿瘤大小、TNM分期正相关[15]。这些研究表明，lncRNA TUG1与肿瘤发生正相关，并与疾病进程或临床病理恶性程度相关。本研究发现，CC癌组织lncRNA TUG1表达水平高于配对的癌旁组织，与上述临床研究结果趋势一致。进一步的关联分析发现，lncRNA TUG1表达水平与FIGO分期正相关。这原因可能是lncRNA TUG1可通过调节Wnt/β-catenin或ETM等多条信号通路促进肿瘤细胞的增殖、迁徙以及侵袭[18-22]。

lncRNA TUG1高表达与患者预后不良密切相关。lncRNA TUG1高表达与肾透明细胞癌患者较短的OS相关，Cox比例风险模型分析显示，lncRNA TUG1 高表达是肾透明细胞癌患者较差OS的独立预测因素[17]。在高度肌层浸润性膀胱癌中，lncRNA TUG1高表达与患者较差的OS相关[21]，且lncRNA TUG1高表达是骨肉瘤患者OS和无进展生存期差的独立预测因素[20]。本研究显示，癌组织lncRNA TUG1高表达是CC患者OS较差的独立预测因素，且肿瘤≥4 cm、FIGO Ⅱ期、淋巴结转移阳性和宫颈基层浸润深度≥2/3也是CC患者OS较差的独立预测因素，这可能是由于lncRNA TUG1可能通过促进癌细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡和通过诱导EMT等促进癌细胞侵袭，以及可降低患者辅助放疗和(或)化疗敏感度治疗有关[16,18-22]。

本研究还存在一些局限：(1)样本量相对较小，导致数据缺乏统计效能。因此，未来的研究应扩大样本量以进一步验证lncRNA TUG1表达水平与CC患者临床病理及预后的关联；(2)本研究纳入的CC患者仅为FIGO Ⅰ～Ⅱ期，无Ⅲ期及Ⅳ期患者，未能评估lncRNA TUG1表达水平在Ⅲ期、Ⅳ期患者中的预后作用。由于FIGO Ⅳ期患者手术比例低，难以获取肿瘤组织样本，在一定程度上限制了lncRNA TUG1在FIGO Ⅳ期患者中预后作用的研究。(3)患者接受的治疗方式不同，可能会影响患者术后的生活质量进而影响患者的生存，今后需进一步细化患者的入排标准，评估患者术后的生活质量，以排除治疗方式对研究结果的干扰。