瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治疗原发性肝癌的机制研究

俞力 刘苏

原发性肝癌是当前常见的人类恶性肿瘤之一[1]。肝癌的病情的发生、发展以及转移等与多种基因突变、细胞信号传导通路等分子水平机制密切关联[2]。寻找一个有效的、敏感性及特异性较强的生物学靶点已成为临床治疗原发性晚期肝癌及阻止肿瘤转移的研究的热点。本研究探讨瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治疗原发性肝癌的机制研究。

资料与方法

一、一般资料

本研究于2016年1月至2018年10月间收集于本院就诊并接受治疗的原发性晚期肝癌患者60例，全部经病理学确诊；本研究中受试对象的平均发病年龄为 (53.61±9.59)岁。研究中的排除标准：研究排除近期(半年内)使用过VEGFR-TKI小分子药物治疗者；排除同时罹患高血压、冠心病等疾病患者；排除吞咽困难、慢性腹泻、消化溃疡等肠道疾病者以及怀孕或哺乳期女性患者。本研究中患者使用的治疗方案如下：口服瑞戈非尼(160 mg)，服药时间和疗程细则：d1～d21，28 d为一个疗程。疗效判断依据RECIST完成评定，并计算总有效率。

二、免疫组织化学法检测BRAF的蛋白表达水平

取原发性晚期肝癌患者癌组织石蜡切片标本，加入单克隆抗体BRAF和碱性磷酸酶二抗，进行4 ℃过夜孵育，次日加入SP和DAB进行显色，封片并用显微镜进行观察。计算癌组织中BRAF蛋白表达的平均光密度(mean density)。

三、细胞培养及细胞存活率

选取人肝癌SMMC-7721细胞株，使用胎牛血清作为RPMI培养液，浓度为10%，温度控制在37 ℃，同时在5% CO2条件下进行复苏培养。研究总共取对数生长期细胞用于后续分析，(细胞存活率实验)，用瑞戈非尼(0.5 μmol/L，24 h)处理SMMC-7721细胞后更换培养基，再加入CCK8(10 μL)培养，培养条件：温度仍然控制字37℃，同时在5% CO2条件下完成培养，培养时间为2 h，最后使用酶标仪测定OD值(450 nm波长处测定)，研究中通过比较分析细胞存活率和细胞凋亡率讨论主题。

四、划痕实验

划痕实验中首先使用用瑞戈非尼0.5 μmol/L处理SMMC-7721细胞，24 h后将细胞接种于96孔板上，随后使用划痕仪对准96 孔板下端中央，轻推形成划痕。漂洗(使用无血清培养基)3遍后加入低浓度血清培养24 h，最后对SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力进行评估。

五、Western Blot检测蛋白含量表达

收取肝癌组织及SMMC-7721细胞株的蛋白并检测蛋白浓度(总量调整为30 μg/μL)。将各组肝癌组织及SMMC-7721细胞株蛋白样品进行电泳和转膜，BSA封闭后加入BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2、NF-κB、BCL-2和Caspase 3蛋白的表达一抗和碱性磷酸酶二抗。用显色剂显色并对条带进行灰度扫描分析，计算肝癌组织及SMMC-7721细胞株BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2、NF-κB、BCL-2和Caspase 3蛋白的表达蛋白的表达量。

六、统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件处理数据，计数/等级资料采用例数和百分比描述，卡方检验进行差别的统计学检验；统计检验标准为：P<0.05(提示差异具有统计学意义)。

结 果

一、临床疗效观察

瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治疗原发性肝癌总有效率为58.33%(35/60)。

二、免疫组化结果

原发性肝癌应用瑞戈非尼靶向治疗后，癌组织内BRAF蛋白平均光密度含量明显下降 (P<0.05)，见图1。

图1 BRAF免疫组化结果 (DAB显色×400)

三、SMMC-7721细胞株细胞存活率、迁移和侵袭能力结果

研究中对肝癌SMMC-7721细胞株使用瑞戈非尼处理24 h后，可见细胞存活率显著降低，同时凋亡率显著增高，同时可见细胞迁移和侵袭能力明显减弱(P<0.05)，见图2。

图2 肝癌SMMC-7721细胞株细胞存活率、迁移和侵袭能力结果

四、Western Blot检测蛋白表达水平

原发性肝癌患者应用瑞戈非尼靶向治疗后，癌组织内BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量显著降低，NF-κB和Caspase 3蛋白含量显著升高(P<0.05)，见表1。本研究结果提示，SMMC-7721细胞株使用瑞戈非尼处理后，癌细胞内BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量均可见水平显著降低，而NF-κB和Caspase 3蛋白含量则可见显著升高(P<0.05)，见表2。

讨 论

研究发现Raf基因家族成员中的癌基因BRAF与原发性肝癌等肿瘤的发生发展有关，该基因发挥调控作用的通路为丝分裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)信号转导通路[3]，Ras/Raf/MEK/ERK 信号级联通路是MAPK通路的下游信号系统，主要通过细胞外信号传递入细胞核内，进而调节细胞内特异蛋白表达水平[4]。细胞外信号分子一旦通过转导或其他方式引发机体应激时，BRAF就会发挥MAPKKK的作用，并激活ERK影响细胞的增殖分化[5]。与此同时，NF-kB是磷脂酰肌醇-3-羟激酶PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK下游的主要效应靶蛋白，其具有调控细胞凋亡基因转录等功能[6]，并且它可以抑制BCL-2表达，导致凋亡蛋白caspase 3活化以及凋亡的发生。

本研究结果表明，瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治疗原发性肝癌总有效率为58.33%，疗效显著。原发性肝癌应用瑞戈非尼靶向治疗后，癌组织内BRAF蛋白平均光密度含量明显下降，说明瑞戈非尼可有效抑制肝癌组织内BRAF表达、下调信号通路等方式影响肿瘤发生发展。当采用瑞戈非尼0.5 μmol/L处理肝癌SMMC-7721细胞株24h后，细胞存活率显著降低，细胞迁移和侵袭能力明显减弱，说明瑞戈非尼能持续抑制肝癌细胞的癌基因，肝癌SMMC-7721细胞株应用瑞戈非尼处理后，癌细胞内BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量显著降低(P<0.05)，NF-κB和Caspase 3蛋白含量显著升高(P<0.05)，瑞戈非尼能够抑制肝癌细胞生长和增殖，调控BRAF-RAF-MEK-ERK信号通路促进肝癌SMMC-7721细胞株的细胞凋亡。

综上所述，使用瑞戈非尼进行分子靶向治疗，通过针对BRAF基因的干预完成对原发性肝癌的治疗，主要机制为直接调控BRAF-RAF-MEK-ERK信号通路，通过促进肝癌细胞凋亡完成治疗。希望基于本研究可以为瑞戈非尼的进一步临床应用提供更多的理论依据。

表1 Western Blot检测原发性肝癌患者癌组织内蛋白表达含量

注： 与治疗前相比，*P<0.05

表2 Western Blot检测肝癌SMMC-7721细胞株内蛋白表达含量

注： 与治疗前相比，*P<0.05