五酯胶囊和CYP3A5*3 多态性与肾移植术后早期他克莫司血药浓度相关性研究

王学彬 ，邢文荣，郑胜男，陆瀚澜，杨云云，王卓（.上海长海医院药学部，

上海 200433； 2.上海交通大学附属儿童医院药学部，上海 200062； 3.安徽省儿童医院 药学部，安徽 合肥 340111；4.徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221004；5.上海 长海医院器官移植科，上海 200433）

中国成人慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的患病率为10.8% （10.2%～11.3%），是危 害国人健康的重要慢性疾病［1］。CKD 应积极干预和治疗，肾移植是CKD 尿毒症期最有效的治疗手段，移植术后需终身使用免疫抑制剂。他克莫司（tacrolimus，Tac）是目前临床肾移植术后一线抗排斥反应药物之一［2］。Tac 治疗窗窄、药动学个体差异大，其精确个体化给药是肾移植成功与移植肾长期存活的关键［3］。

Tac 代谢个体差异大，主要受肝与肠壁内的细胞色素P450 （cytochromeP450，CYP450） 同工酶 （CYP3A5 和CYP3A4）影响［4］。中国人群CYP3A5*3和CYP3A4*18B（即CYP P3A4*1G）基因突变频率分 别 为50% ～ 70%和20%， 其 中CYP3A4*18B 与CYP3A5*3 存在高度的连锁不平衡现象，说明中国肾移植受者Tac 的代谢主要受CYP3A5*3 基因多态性的影响［5］。2015 年临床药物遗传学实施联盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium，CPIC）指南 和2019 年Tac 治疗药物监测 （therapeutic drug monitoring， TDM）专家共识推荐应基于CYP3A5*3 基因型制订肾移植受者Tac 初始给药方案，并根据TDM 结果调整剂量［6-7］。

Tac 不仅代谢个体差异大，而且费用昂贵，给器官移植受者带来沉重的经济负担［8］。国内部分移植中心常联用五酯胶囊（或片）用于提升Tac 血药浓度及节约药费，且已证实五酯胶囊/片对Tac 的增效作用受CYP3A5*3 基因多态性的影响，CYP3A5*3 表达者（*1/*1 和*1/*3） 较非表达者 （*3/*3）敏感［9-10］。然而，目前临床为肾移植受者制订Tac 联合五酯胶囊的初始给药方案多为经验式，其科学性值得推敲。本研究旨在探究五酯胶囊不同剂量和CYP3A5*3 多态性对肾移植受者术后早期Tac 血药浓度的影响及特点，从而为临床科学制订Tac 联合五酯胶囊初始给药方案提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象：选择2016 年1—12 月在上海长海医院接受同种异体肾移植术的受者。采集术前临床基本资料，并收集术后第3、7 和14 天的免疫抑制剂方案及Tac TDM 结果。本方案经第二军医大学生物医学研究伦理委员会批准（审批号：20190301）。

入选标准：① 首次进行同种异体肾移植术者；② 供肾来源于DCD 或者亲属活体者；③ 使用Tac为基础免疫抑制剂者；④ 年龄大于18 岁和小于 65 岁者；⑤ 联用五酯胶囊用以提升Tac 血药浓度者。

排除标准：① 使用环孢素或14 d 内将Tac 替换为环孢素者；② 使用Tac 注射剂者；③ 联用五酯胶囊以外可影响Tac 浓度药物者（地尔硫、琥乙红霉素、盐酸小檗碱感冒片、泊沙康唑和伏立康唑等）；④ 移植失败者。

1.2 仪器与药品

1.2.1 仪器：ARCHITECTi1000SR 全自动免疫分析仪（雅培，美国），Abbott 离心机（雅培，美国），电冰箱（BCD-322WKG33NA2L0C，西门子），移液枪（20 ～200 μl，NZ44003，Thermo；10 ～100 μl， Transferpette），9700PCR 扩增仪、3730-XL 测序仪（ABI，美国）等。

1.2.2 药品：Tac（杭州中美华东制药有限公司，批准文号：H200094027，规格：0.5 mg）；麦考酚酸钠肠溶片（瑞士Novartis Pharrna SchweizAG，注册证 号：H20080647，规格：180 mg）；甲泼尼龙琥珀酸钠注射液（Pfizer Manufacturing Belgium NV，注册证号：H20130303，规格：40 mg）；醋酸泼尼松片 （上海上药信谊药厂有限公司，批准文号：国药准字H31020675，规格：5 mg）；五酯胶囊（四川禾正制药有限公司，批准文号：国药准字Z10983013，规格：每粒含五味子甲素11.25 mg）。

1.3 抗排斥反应方案

1.3.1 三联免疫抑制剂方案：Tac 胶囊+麦考酚酸钠肠溶片+糖皮质激素。① Tac 胶囊：起始日剂量为 0.05 ～ 1.0 mg/kg，1 次/ q 12 h，空腹服用（餐前1 h或餐后2 ～ 3 h）；② 麦考酚酸钠肠溶片：每次180 ～ 360 mg，1 次/ q 12 h，于餐后0.5 h 口服；③ 糖皮质激素：甲泼尼龙琥珀酸钠注射液每日240 ～ 480 mg，每天 1 次，逐日减量至40 mg，后转换为口服醋酸泼尼松片， 并调整至2.5 ～ 10 mg/d，晨起餐后0.5 h 口服。

1.3.2 五酯胶囊给药方案：4 种用药情况分别是 0 mg / d、22.5 mg / d（11.25 mg /次，2 次/ d）、45 mg / d （22.5 mg/次，2 次/ d）和67.5 mg / d（33.75 mg /次，2 次/ d），使用时与Tac 同服。

1.4 Tac 血药浓度测定：肾移植受者于晨起06：30 ～ 07：00（服药前0.5 h）期间抽取外周静脉血样1 ml，置于15% EDTA-K2抗凝管中。根据Tac 检测试剂盒（Abbott，美国）说明书对血样进行预处理，使用化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CMIA）和Abbott ARCHITECTi1000SR 分析仪测定Tac血药谷浓度（trough concentration，C0）。计算Tac 剂量调整血药谷浓度C0/D，以C0除以经体质量校正的Tac 日剂量（dose，D）。

1.5 CYP3A5*3 基因分型：① DNA 提取 留取测定Tac 浓度后剩余血样，按照TaKaPa 试剂盒说明书提取DNA。②CYP3A5*3（rs776746）引物设计 委托上海欧易生物有限公司完成。正向引物：5’-ACTGCCCTTGCAGC ATTTA-3’；反 向 引 物：5’-CCAGGAAGcCAGACTTTGA-3’， 引 物 长 度 为 393 bp。③PCR 反应体系 取1 μl DNA 模板置于PCR管，加 入10×Taq Buffer 3 μl、50×dNTPmix、正 向引物与反向引物各0.5 μl 及TaKaPa rTaq 0.4 μl，补充ddH2O 至反应体积40 μl。在美国ABI 公司9700 PCR仪上进行扩增，循环参数：95℃×2 min，95℃×20 s， 55℃×20 s，72℃×30 s，35 个循环，72℃×10 min。 ④ 基因分型：使用美国ABI 公司ABI 3730-XL 测序仪进行测序及确定CYP3A5*3 基因型。

1.6 统计学方法：使用PLINK 软件（PLINK 1.90 beta， Purcell Lab， Mount Sinai School of Medicine， NY）对CYP3A5*3 等位基因及基因型频率进行分析，使用χ2检验进行Hardy-Weinberg 遗传平衡分析。

使 用SPSS 21.0 软 件（SPSS， Chicago City， USA）对数据进行处理，采用Shapiro-Wilk 和 Levene 法先后对计量资料进行正态性及方差齐性检验。具有正态性分布及方差齐性数据以均数±标准差 （±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One -way ANOVA）或Student Newman Keuls（SNK）检验。不具有正态性分布的数据以中位数（四分位数）M（QL，QU）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H （K-W）或Mann-Whitney U（M-W）检验。P ＜0.05 具有统计学差异。

2 结 果

2.1 基本资料：共纳入109 例肾移植受者，术前临床基本资料见表1。

表1 基本资料 （n ＝109）

图1 五酯胶囊对肾移植受者术后早期Tac C0/D 的影响

图2 五酯胶囊对不同CYP3A5*3 基因型肾移植受者术后早期Tac C0/D 的影响

2.2 CYP3A5*3 基因分型：109 例肾移植受者中，有101 例进行了CYP3A5*3 基因分型。基因型*1/*1、*1/*3 和*3/*3 分别占9.9%（10 例）、32.7%（33 例）和57.4%（58 例），等位基因*1 和*3 频率分别为26.2%和73.8%（即CYP3A5*3 突变频率为75.6%）。经过χ2检验符合Hardy-Weinberg 遗传平衡（χ2＝2.45，P ＝0.12）。

2.3 五酯胶囊对Tac 血药浓度的影响：不考虑CYP3A5*3 影响时，肾移植术后第3 天，随着五酯胶囊剂量增加（0，22.5 和45 mg），Tac C0/D 呈上升趋势，但无显著性差异（P ＞0.05）；第7 天3 组之间的Tac C0/D 无显著性差异（P ＞0.05）。然而，第14 天五酯胶囊67.5 mg 组Tac C0/D 显著低于22.5 mg 组〔133.86 （112.80，140.25） 比138.86（109.17，216.75） ng/ml，P ＝0.020〕和45 mg 组〔133.86（112.80，140.25）比154.86（128.71，226.44） ng/ml，P ＝0.016〕（图1）。 对于CYP3A5 表达者（*1/*1+*1/*3），术后第3、7 和14 d，随着五酯胶囊剂量的增加（0，22.5 和 45 mg），Tac C0/D 呈上升趋势，且存在显著性差异（P ＜0.05）。然而，第14 天五酯胶囊剂量增加到67.5 mg 时，与22.5 mg 和45 mg 组比较，C0/D 并未继续升高。对于CYP3A5 非表达者（*3/*3），第3天和第7 天随着五酯胶囊剂量增加， C0/D 无显著性升高（P ＞0.05），但第14 天五酯胶囊45 mg 组的 C0/D 显著低于22.5 mg 组〔168.50（127.43，155.15）比168.50 （123.97，232.77）ng/ml，P ＝0.011〕（图2）。

2.4 CYP3A5*3 对Tac 血药浓度的影响：不考虑五酯胶囊影响时，肾移植术后第3 和7 天，CYP3A5*1/*3肾移植受者Tac C0/D 均显著低于*3/*3 者（P ＜0.05），但第14 天不同CYP3A5 基因型之间的C0/D 无显著性差异（P ＞0.05）（图3）。

图3 CYP3A5*3 多态性对肾移植受者术后早期Tac C0/D 的影响

图4 CYP3A5*3 多态性对不同五酯胶囊剂量组肾移植受者术后早期Tac C0/D 的影响

对于五酯胶囊不同日剂量组（0、22.5 和45 mg），肾 移 植 术 后 第3、7 和14 天，CYP3A5 表 达 者 Tac C0/D 均显著低于非表达者（P ＜0.05）（图4）。

3 讨 论

Tac 作用强、不良反应少，逐渐替代环孢素，已成为肾移植术后抗排斥反应一线药物［2，5］。但Tac治疗窗窄、个体差异大，CYP3A5*3 非表达者（*1/*1和*1/*3）较CYP3A5*3 非表达者（*3/*3）需要更高的Tac 日剂量［7］。然而，Tac 价格昂贵，且肾移植受者需终身使用，给患者及医保带来较大的经济负 担［8］。联用五酯胶囊具有提升Tac 血药浓度和降低药费的双重作用，其机制为五酯胶囊的主要活性成分五味子甲素与Tac 竞争CYP3A5 酶结合位点后，形成竞争性抑制，进而降低Tac 代谢速率，从而提升Tac浓度。目前已证实这种增效作用受CYP3A5*3 基因多态性的影响［9-10］。Li 等［9］临床前瞻性研究证实，五酯片（0.62 g，tid）适宜于作为CYP3A5 表达者Tac 的增效药物。杨燕等［10］研究证实，当肾移植受者五酯胶囊（22.5 mg）和Tac 联用时，CYP3A5*3 不同基因型之间的Tac C0/D 有显著性差异：对于CYP3A5 表达者，五酯胶囊对术后3 ～ 12 个月Tac 的增效作用显著；对于CYP3A5 表达者和非表达者，五酯胶囊对术后 1 个月Tac 均具有显著增效作用（CYP3A5 表达者更敏感）。然而，目前鲜见考察五酯胶囊不同日剂量对于CYP3A5 不同基因型肾移植受者术后14 d 内的Tac增效作用研究。

本回顾性研究发现，不考虑CYP3A5*3 多态性影响时，移植术后第3 天和第7 天，联用五酯胶囊组 （22.5 mg 和45 mg）和未联用组（0 mg）的Tac C0/D之间并无显著性差异（图1 A 和B），但第14 天五酯胶囊67.5 mg 组的C0/D 却显著低于低剂量组（22.5 mg和45 mg）（图1 C）。对于CYP3A5*3 表达者，术后第 3 和7 天联用五酯胶囊组（22.5 mg 和45 mg）的C0/D均显著高于未联用组（0 mg）（图2 A 和B）；术后第3、7 和14 天，五酯胶囊45 mg 组的C0/D 显著均显著高于22.5 mg组 （图2 A、B和C）。不考虑五酯胶囊影响时， CYP3A5*3/*3 肾移植受者术后3 和7 d 的Tac C0/D 均显著性高于CYP3A5*1/*3 者 （图3 A 和B）。对于五酯胶囊各剂量组（0、22.5 mg 和45 mg），CYP3A5 表达者术后3、7 和14 d 的Tac C0/D 均显著低于非表达者（图4）。然而，对于肾移植术后第14 天，CYP3A5表达者五酯胶囊67.5 mg 组的C0/D 低于45 mg 组 （图2 C），同时CYP3A5*3/*3 者五酯胶囊45 mg 组的Tac C0/D 显著低于22.5 mg 组（图2 D）。然而，这种增加五酯胶囊日剂量，Tac 浓度“不升反降”的现象及机制并不明确，有待进一步深入探究。

该研究结果初步表明，五酯胶囊应作为CYP3A5表达者肾移术后初始Tac 给药方案的增效剂，其最大日剂量应为45 mg，若45 mg 未达到预期效果，建议增加Tac 日剂量或联用其他增效药（如地尔硫）。

本研究仍有一定局限性： ① 小样本（仅109 例）的回顾性研究；② 基因仅考虑了CYP3A5*3，因为PXR 和ABCB1 等基因也可能对肾移植术后早期Tac的增效作用有影响［4，11-12］；③ 肾移植术后早期病情复杂，多种因素（如肌酐清除率、红细胞压积和肝功能）均可能有影响，应使用多因素分析和PPK （或 PBPK）模型，以全面筛查影响因素，并精确制订Tac 联合五酯胶囊的初始给药方案［13-14］。因此，下一步将扩大样本量及影响因素，对本研究的结论进一验证和完善。综上，CYP3A5 表达的肾移植受者，五酯胶囊 （日剂量22.5 mg 和45 mg）可作为肾移术后早期Tac 给药方案制订及调整的增效药物。