IGF-1、mtDNA及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平在盆底器官脱垂患者组织表达研究

2020-06-08 15:23陈春经林焕明
中外医学研究 2020年9期
关键词:盆底线粒体氧化应激

陈春经 林焕明

【摘要】 目的:研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、线粒体DNA(mtDNA)及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ在盆底器官脱垂(POP)患者的组织表达。方法:收集笔者所在医院POP患者50例作为研究组,同时选择同期行子宫切除术的良性非POP患者50例作为对照组。比较两组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值,以及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。结果:研究组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值分别为(0.41±0.09)、(0.47±0.08)、(0.56±0.11),均低于对照组的(0.85±0.11)、(0.92±0.13)、(0.93±0.12),差异有统计学意义(P<0.05)。研究组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值分别为(3.36±0.12)、(5.44±0.18)、(5.16±0.13),均低于对照组的(4.49±0.14)、(7.17±0.19)、(6.87±0.15),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:POP患者宫骶韧带-子宫主韧带的mtDNA、胶原蛋白ⅠmRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白表达均为下调趋势,可能参与了POP的发生、发展。

【关键词】 盆底器官脱垂 胰岛素样生长因子-1 线粒体DNA 胶原蛋白Ⅰ 胶原蛋白Ⅲ

[Abstract] Objective: To study the expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1), mitochondrial DNA (mtDNA) and collagen Ⅰ, Ⅲ in the tissues of patients with pelvic organ prolapse(POP). Method: A total of 50 POP patients in our hospital were collected as the study group, and 50 benign non-POP patients who underwent hysterectomy at the same time were selected as the control group. The relative density values of mtDNA, collagen Ⅰ mRNA and collagen Ⅲ mRNA, and the gray value of IGF-1, collagen Ⅰ protein, collagen Ⅲ protein were compared between the two groups. Result: The relative density values of mtDNA, collagen Ⅰ mRNA, collagen Ⅲ mRNA in the study group were (0.41±0.09), (0.47±0.08) and (0.56±0.11), which were lower than (0.85±0.11), (0.92±0.13) and (0.93±0.12) in the control group, the differences were statistically significant (P<0.05). The gray values of IGF-1, collagen Ⅰ proteins, collagen Ⅲ proteins in the study group were (3.36±0.12), (5.44±0.18) and (5.16±0.13), which were lower than (4.49±0.14), (7.17±0.19) and (6.87±0.15) in the control group, the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: The level of mtDNA, collagen Ⅰ mRNA, collagen Ⅲ mRNA and IGF-1, collagen Ⅰ protein, and collagen Ⅲ protein expressions of uterosacral ligament-uterine main ligament in POP patients are all down-regulated, which may be involved in the occurrence and development of POP.

盆底器官脫垂(POP)主要是由于盆底支持结构缺陷或者退化、损伤及功能障碍所导致,是影响中老年女性生活质量的常见疾病。POP的发病因素复杂,机体老化、氧化应激在POP的发生发展中扮演着重要角色[1]。有研究发现,机体内过多的活性氧(ROS)可对线粒体DNA(mtDNA)造成氧化损伤[2]。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)作为一促存活因子,在多种细胞系中均表现出其抗氧化应激、抗细胞凋亡的特性[3]。PI3K/AKT信号通路被认为是最主要的促进细胞存活的一条信号通路[4],mtDNA、IGF-1、PI3K/AKT信号通路在维持机体氧化应激/抗氧化应激平衡过程中有着重要作用,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的变化与POP的发展关系密切。本研究旨在通过检测宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体IGF-1、mtDNA及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达,为防治POP探求新的思路,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集笔者所在医院2018年1月-2019年3月临床POP患者50例作为研究组,同时选择同期行子宫切除术的良性非POP患者50例作为对照组。研究组纳入标准:均为已婚已育女性;经临床确诊为POP患者。对照组纳入标准:均为已婚已育女性;非POP患者;子宫肌瘤、子宫内膜异常增生及宫颈病变患者。排除标准:妇科恶性肿瘤、妊娠期或哺乳期患者;长期服用避孕药、雌激素等激素类药物者;有既往盆腔手术史者;吸烟及滥用药物史者。两组患者均经手术治疗,并获得宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体标本。研究组年龄(43.51±10.42)岁;POP分期:Ⅱ期11例,Ⅲ期24例,Ⅳ期15例。对照组年龄(43.79±9.89)岁;子宫肌瘤25例,子宫内膜异常增生18例,宫颈病变7例。两组患者基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),有可比性。

1.2 方法

两组均于手术治疗时取宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体标本,获得非POP及POP组织,应用定量RT-PCR方法检测两组宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体标本,检测mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA水平的表达,具体步骤:RNA提取、反应体系配制、加RNA模板、RT-PCR反应、2.0%琼脂糖凝胶制备、电泳、RT-PCR产物检测,将电泳胶放入凝胶成像系统观察,以内参基因为基准分析各条带的相对密度值。

采用免疫蛋白印记法(western-blot)检测两组标本IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白的表达。主要步骤:SDS-PAGE凝胶制备及灌胶,上样、电泳、切胶及制备硝酸纤维素膜(PVDF)、转膜、抗原封闭、加入一抗、二抗,在避光条件下显影,凝胶扫描成像系统分析,评估相对灰度值。

线粒体DNA(mtDNA)核酸检测试剂盒(北京索奥生物医药科技有限公司),人IGF-1试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司),人胶原蛋白ⅠmRNA、人胶原蛋白Ⅲ mRNA、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白试剂盒(上海科顺生物科技有限公司);凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 观察指标

比较两组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值。比较两组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理,计量资料以(x±s)表示,采用t检验,计数资料以率(%)表示,采用字2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值结果比较

研究组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.2 两组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值结果比较

研究组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

3 讨论

盆底支持组织主要包括韧带、多层肌肉和筋膜,正常子宫位置的维持需要靠子宫韧带、骨盆底肌和筋膜的共同支托。宫骶韧带-子宫主韧带复合体在盆底支持结构中起最主要支持力量,该韧带复合体正常形态、位置和功能的异常,影响盆底正常功能,可最终导致POP的发生。妊娠、阴道分娩损伤、肥胖、便秘等多种因素是POP的诱因,盆底支持组织中分子生物学水平与POP的发生密切,氧化应激、炎性刺激等参与了POP的发生、发展过程[5]。

本次研究结果显示,研究组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白表达均低于对照组(P<0.05)。线粒体是真核细胞能量提供和储存的场所,还在细胞凋亡中发挥重要作用。有学者发现POP患者盆底组织中存在mtDNA缺失和重排的累积,且随着POP程度的加重而明显累积[6]。mtDNA突变和氧化损伤的累积,促进机体的老化,引起盆底支持结构解剖及功能的异常,最终导致POP的发生。ROS主要包括超氧陰离子(O2-)、羟基(-OH)和过氧化氢(H2O2),主要来源于细胞中线粒体。随着年龄的增长,ROS水平呈增长趋势,而ROS清除机制却呈退化趋势,二者之间的平衡被打破,氧化应激导致mtDNA氧化损伤,引起突变,产生有缺陷的电子传递链(ETC)组分,导致更多ROS产生和mtDNA突变,引起呼吸链有关蛋白质亚单位的合成障碍,形成有缺陷的呼吸链,导致机体细胞ATP合成水平降低和细胞能量供给不足,致使细胞损伤[7-8]。

IGF-1的生物学活性是通过在胞外区域与IGF-1受体(IGF-1R)相结合,然后使跨膜区的IGF-1R亚基结构发生改变,引起自身磷酸化作用并激活其亚基内酪氨酸(Tyr)激酶,促使下游底物发生一系列的磷酸化,启动细胞内的PI3K/AKT等信号通路,调整细胞的生长、增殖及凋亡等生物学效应[9-10]。PI3K/AKT信号通路与细胞生长、炎性反应及细胞凋亡有着重要联系。PI3K是胞内磷脂酰肌醇激酶,参与细胞的能量代谢、增殖、分化及凋亡。AKT的激活,进一步激活其下游的分子信号,以直接或者间接的方式来调整细胞的生存与生长[11]。随着年龄的不断增长,氧自由基的产生与清除之间的平衡失调,引起细胞ROS增加,过量的ROS进入细胞核导致核内DNA损伤,引起细胞周期停滞和细胞凋亡。IGF-1可通过激活PI3K/AkT信号通路,提高细胞内SOD、GPx活性,促进细胞ROS的清除[12]。

胶原蛋白含量是决定盆底结缔组织韧性强弱的重要因素,盆底结缔组织中主要含Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,Ⅰ型胶原蛋白是由3条肽链组成的一种重要的、基本的蛋白质,Ⅰ型胶原蛋白直径较粗,抗张能力强,起支持作用;Ⅲ型胶原蛋白直径较细,柔韧性强。胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平下降,胶原合成代谢发生紊乱,引起支撑盆腔肌纤维强度降低,影响盆底结构和功能,使其韧性、弹力降低,导致POP的发生[13]。因此,POP发生的分子机制可能是,mtDNA的氧化损伤、IGF-1通过PI3K/AKT信号发挥其抗氧化应激能力,以优化机体微环境减缓POP的进展,胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成降低,导致盆底子宫韧带形态、位置和功能的失常。

综上所述,POP患者宫骶韧带-子宫主韧带的mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、Ⅲ mRNA及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白表达均为下调趋势,可能参与了POP的发生。

参考文献

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(收稿日期:2020-01-09) (本文编辑:桑茹南)

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