基因芯片筛选ghrelin miRNA转染胰腺炎细胞模型后的差异表达基因*

唐曦平 张露艺 梁志海 覃蒙斌 唐国都#

广西医科大学附属肿瘤医院内镜中心1(530021) 广西医科大学2 广西医科大学第一附属医院消化内科3 广西医科大学第二附属医院消化内科4

背景：前期研究提示ghrelin在急性胰腺炎发病过程中发挥重要作用，但其机制尚不明确。目的：应用基因芯片技术筛选出ghrelin miRNA转染胰腺炎胰腺腺泡细胞后的差异表达基因。方法：以雨蛙肽构建胰腺炎胰腺腺泡细胞模型。将AR42J细胞分为ghrelin miRNA+雨蛙肽组、阴性对照+雨蛙肽组。提取细胞RNA，合成为ds-DNA，与大鼠全基因组基因芯片杂交、扫描、分析。筛选与炎症和钙通路相关的差异表达基因，并采用RT-PCR法对其中3个基因(Bcl-2、caspase-8、caspase-12)进行验证。结果：给予AR42J细胞ghrelin miRNA+雨蛙肽干预后，共筛选出2 938个差异表达基因，其中1 435个基因表达上调，1 503个基因表达下调。与CAMP/Ca2+信号通路相关的差异表达基因有60个，与炎症通路相关的差异表达基因有199个。RT-PCR结果表明，ghrelin miRNA+雨蛙肽组Bcl-2、caspase-12表达下调，caspase-8表达上调，与基因芯片筛查结果一致。结论：基因芯片技术可筛选出ghrelin miRNA转染胰腺炎胰腺腺泡细胞过程中发挥关键作用的基因，从而为研究内源性ghrelin对胰腺炎胰腺腺泡细胞的作用机制提供依据和参考。

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床常见的急腹症，随着社会生活水平的提高、生活方式与饮食结构的转变，其发病率呈逐年上升趋势。虽然多数AP属自限性疾病，但仍有部分患者出现多器官功能障碍综合征、全身炎症反应综合征或局部并发症，并有可能导致病情进一步恶化成重度AP，总体死亡率可高达10%～15%[1-5]。因此，寻找新的治疗方案以降低AP发病率已迫在眉睫。Ghrelin是新近发现的一种脑肠肽，主要由胃肠道合成和分泌，其主要生理功能是促进生长激素的分泌，而新近多项研究表明ghrelin在炎性反应中也具有重要作用[6-10]。动物和细胞实验发现ghrelin与AP密切相关[11-12]，但ghrelin在AP疾病过程中发挥作用的机制尚不明确。本研究首次通过运用基因芯片技术筛选出ghrelin miRNA干扰胰腺炎胰腺腺泡细胞后的差异表达基因，并对差异显著的基因进行验证，从而为研究内源性ghrelin对胰腺炎胰腺腺泡细胞的作用机制提供依据和参考。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

大鼠胰腺外分泌细胞株AR42J(美国典型培养物保藏中心，ATCC)。

雨蛙肽(美国Sigma公司)；慢病毒浓缩液和阴性对照慢病毒液(美国Invitrogen公司)；大鼠12×135K全基因组基因芯片(罗氏NimbleGen)；测试服务和数据分析(上海康成生物工程有限公司)。

二、实验方法

1.细胞培养和实验分组：AR42J细胞置于含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的F12K培养液中培养。转染前将AR42J细胞接种于6孔板，根据预实验结果和前期研究基础，将AR42J细胞分为ghrelin miRNA+雨蛙肽组(A组)和阴性对照+雨蛙肽组(B组)。首先分别加入ghrelin miRNA和阴性对照慢病毒载体转染细胞培养48 h，然后加入10-7mol/L雨蛙肽，构建AP腺泡细胞模型[11,13-16]，继续培养24 h，收取细胞和培养上清液，并提取细胞总RNA和总蛋白，行后续实验。

2.RNA提取和基因芯片技术：各组细胞中加入Trizol试剂，具体步骤根据说明书进行操作，将总RNA合成为ds-DNA，按照NimbleGen基因表达分析手册纯化和标记ds-DNA，与基因芯片进行杂交后，用Axon GenePix 4000B基因芯片扫描仪进行扫描，分析表达数据，标准化，筛选出差异表达基因，并筛查出与炎症通路和钙通路相关的表达上调和下调2倍以上的差异基因。

3.RT-PCR法：采用Trizol抽提法提取细胞总RNA，反转录成cDNA，行PCR。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。内参β-actin引物上游：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’，产物长度205 bp；Bcl-2引物上游：5’-GAT GGC AAA TGA CCA GCA GA-3’，下游：5’-GCA GGA TAG CAG CAC AGG AT-3’，产物长度346 bp；caspase-8引物上游：5’-CCT CTG ACC TCC GGT GTT TT-3’，下游：5’-GAT CCC GCC GAC TGA TAT GG-3’，产物长度425 bp；caspase-12引物上游：5’-CAG TCC TCC GAC AGC ACA TT-3’，下游：5’-CTG TCT CCA CAT GGG CCT TT-3’，产物长度310 bp。PCR产物行凝胶成像分析，以目的基因灰度值与内参灰度值比值作为目的基因mRNA相对表达量。

三、统计学分析

结 果

一、AR42J细胞RNA样品质检

RNA样品28S、18S条带清晰，无痕量DNA污染。通过紫外分光光度计检测RNA和ds-DNA样品，A260 nm/A280 nm比值、A260 nm/A230 nm比值均>1.8，说明已获得较高纯度完整的总RNA，满足实验条件(图1)。

二、差异基因表达谱

与B组相比，A组基因芯片筛选出上调或下调2倍以上的基因共2 938个，其中1 435个基因表达上调，1 503个基因表达下调。

三、与炎症和钙通路相关的差异表达基因

运用Agilent GeneSpring GX 11.5.1系统对上调和下调2倍以上的差异表达基因进行进一步分析，筛选出与CAMP/Ca2+信号通路相关的基因60个，包括caspase-12、Rplp1、Ccna1、Thbs1、Per1、B2m、Brca1、Egr1等(表1)；筛选出与炎症通路相关的基因199个，包括Bcl-2、caspase-8、Birc2、Birc3、CCl2、CCl7、Aimp1、Bmp2等(表2)。

四、RT-PCR法验证结果

图1 总RNA的琼脂糖电泳

表1 与CAMP/Ca2+信号通路相关的部分差异表达基因

表2 与炎症通路相关的部分差异表达基因

选取3个可能与炎症通路、CAMP/Ca2+信号通路关系密切的基因(Bcl-2、caspase-8、caspase-12)进行验证，RT-PCR结果显示，与B组相比，A组Bcl-2、caspase-12表达下调，caspase-8表达上调(图2)，与基因芯片筛选结果一致。

图2 ghrelin miRNA+雨蛙肽干预AR42J细胞后Bcl-2、caspase-8、caspase-12表达(RT-PCR法)

讨 论

Ghrelin是一种新型肽，主要由胃X/A样细胞产生，在许多其他组织中亦可检测到[17]。作为一种有效的生长激素促分泌素，ghrelin是各种生理和疾病过程中的关键因素，主要通过脑-肠轴和中枢神经系统发挥多种功能，其中抗炎作用已得到广泛证实[6-10]。动物实验发现，外源性给予ghrelin可抑制NF-κB p65表达、改善胰腺血流量，从而阻止炎症信号转导通路、减少炎症因子和炎症介质的释放，发挥治疗作用[18-19]。Lai等[20]的胰腺腺泡细胞研究中，外源性给予ghrelin后细胞内Ca2+水平可呈剂量依赖性升高，且呈现瞬间升高期以及随后持续高平台期的双峰状态。但目前内源性ghrelin在AP中的变化尚未完全清楚，本研究的前期研究[11]发现，靶向抑制ghrelin基因可上调AP胰腺腺泡细胞内炎症因子的表达，同时下调细胞内钙超载。推测ghrelin一方面通过抑制炎症因子等发挥炎症反应的防御作用；另一方面，其在AP早期可引起Ca2+浓度增加，导致钙超载。在此基础上，为进一步研究ghrelin基因沉默对AP胰腺腺泡细胞的影响机制，并分析可能发生的基因表达谱变化，本实验利用大鼠全基因组表达谱芯片筛选表达明显改变的基因，并通过生物信息学方法对差异表达基因进行初步分析。基因表达谱芯片技术是通过将大量基因特异性探针固定于同一固相载体上，与待测样品杂交后用荧光检测系统进行扫描、检测，获取每个基因表达数据，具有样品用量少、高通量和快速的特点，适用于分析人类基因组计划的海量基因序列信息。基因芯片可高通量检测样本细胞或组织中基因表达水平，并通过与对照组比较判定实验组差异表达的基因。本研究所用的NimbleGen全基因组芯片可涵盖26 419个基因，探针长度为60 mer。通过多个生物信息学数据库对基因定位、序列、功能等进行注释。本实验将上调或下调2倍以上的基因纳入差异表达谱，结果显示1 435个基因表达上调2倍以上，1 503个基因表达下调2倍以上。Ghrelin miRNA转染胰腺炎胰腺腺泡细胞是一个多基因、多阶段的过程，基因筛查有助于研究ghrelin在AP机制中的作用。

为进一步探索靶向抑制ghrelin后胰腺炎胰腺腺泡细胞内差异表达基因与炎症通路和钙通路的相关性，本实验对上调和下调2倍以上的差异表达基因行进一步筛查，筛选出与CAMP/Ca2+信号通路、炎症通路相关基因。与CAMP/Ca2+信号通路相关基因包括caspase-12、Rplp1、Ccna1、Thbs1、Per1、B2m、Brca1、Egr1等；与炎症通路相关基因包括Bcl-2、caspase-8、Birc2、Birc3、CCl2、CCl7、Aimp1、Bmp2等。有针对性地进行基因筛查有助于筛选出与疾病发生机制密切相关的特异性基因。在这些筛选出的相关基因中，本研究选择了Bcl-2、caspase-8和caspase-12进行验证，结果证实这三个基因在胰腺炎细胞模型内的变化与基因芯片筛查结果一致。

近年AP的研究发现腺泡细胞死亡存在两种不同的方式：坏死和凋亡。在轻度AP中，细胞凋亡可能是机体的一种自我保护行为，与AP严重程度呈负相关。Bcl-2和caspase家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的两类蛋白质，具有抑制凋亡的作用。已有研究发现Bcl-2参与了胰腺炎胰腺腺泡细胞的凋亡机制[21-22]；caspase-8不仅与胰腺炎的细胞凋亡有关[23]，还参与胰腺炎细胞损伤和分泌受阻时网蛋白的降解[24]；动物实验表明caspase-12通过参与重度AP的钙通路机制发挥作用[25]。本研究基因芯片分类筛查发现Bcl-2、caspase-8是与炎症通路相关的差异表达基因，caspase-12是与CAMP/Ca2+信号通路相关的差异表达基因，RT-PCR验证结果显示ghrelin miRNA+雨蛙肽组Bcl-2、caspase-12表达明显下调，caspase-8表达明显上调。表明ghrelin可能通过影响细胞凋亡、网蛋白降解等对胰腺炎胰腺腺泡细胞的炎症通路和钙通路发挥作用，但具体机制尚有待进一步研究予以证实。

综上所述，高效率的基因芯片检测手段可筛选出内源性靶向ghrelin干扰胰腺炎细胞模型的大量差异表达基因，结合软件分析进一步分类筛选出与炎症通路、钙通路相关性较强的差异表达基因，并证实Bcl-2、caspase-8、caspase-12基因与靶向胰腺炎胰腺腺泡细胞中ghrelin的机制密切相关，为进一步深入探讨ghrelin在胰腺炎发生、发展中的机制提供了新的思路和方向。但由于基因芯片筛查的信息量较大，需要在分析技术和软件方面进一步改进、更新，以获得特异性更高的筛查结果。此外，本研究局限于细胞实验，仅提供了细胞水平的依据，因此有待从动物实验方面着手开展深入研究，这将更有利于探讨ghrelin在AP中的影响机制。