过表达microRNA-144通过靶向调节泛素样PHD和环指结构域1基因诱导非小细胞肺癌凋亡

张冉冉，张月怡，宫 铮，李 波*

0 引言

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的一种主要类型[1]，约占所有肺癌病例数目的80%[2]。近年来，分子靶向药物开发成为研究重点，有助于提高癌症患者的整体生存率和生活质量[3]。然而，肺癌发病机制的分子基础尚不清楚。因此，探寻有效的NSCLC治疗方法，寻找新的、有前景的靶基因势在必行。

微小RNA(miRNAs)是一种广泛存在于各种生物体内的非编码RNA[4]，可作为基因表达的负调控因子，靶向诱导mRNA降解或抑制翻译过程，从而参与细胞分化、增殖、凋亡等多种过程[5]。研究表明，异常表达的miRNA能对NSCLC的发生发展过程发挥致癌或抑癌作用[6]。miRNA正在成为NSCLC治疗中新的潜在治疗靶点[7]。因此，发现新的参与NSCLC病理过程中关键miRNA尤为重要。

UHRF1通过参与DNA损伤及修复参与多种疾病的发生发展，如NSCLC[8]。本课题组前期结果表明，UHRF1能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制NSCLC细胞增殖。然而，miR-144与UHRF1对于NSCLC的关系鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与细胞转染 人非小细胞肺癌细胞系(A549)购自American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA，USA)。miR-144 mimic、miR-144 inhibitor以及阴性对照物(NC)购自广州RiboBio Co.,Ltd(广州，中国)。细胞转染使用lip2000转染试剂盒。

1.2 检测miRNA表达 使用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)从临床组织或培养细胞中提取总miRNA，按说明书使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行逆转录。使用TaqMan microRNA检测试剂盒(Applied Biosystems)实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-144表达。U6作为相对miR-1179表达正常化的内参。

1.3 细胞活性实验 采用CCK-8细胞活性试剂盒(广州RiboBio有限公司)测定细胞活性能力。按照说明书的操作流程，转染相应miRNA 48 h后，加入5 mg/ml CCK-8溶液(10 ml/孔)的新鲜培养基替代。将细胞在37 ℃暗处培养4 h。酶标仪(美国加州森尼维尔市分子装置公司)在570 nm处测定溶液吸光度。

1.4 靶向荧光素酶检测 将携带预测miR-144结合位点的3′-UTR片段插入pmirGLO质粒(Promega，Madison，WI，USA)中，以生成靶点荧光素酶基因。将293T细胞接种到24孔板上，与荧光素酶载体和miR-144 mimic或NC阴性对照共转染48 h。制备细胞提取物，根据说明书使用双荧光素酶检测系统(Promega)测定荧光素酶活性。

1.5 qRT-PCR分析mRNA表达 用TRIzol试剂提取总RNA，用TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems)逆转录成cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系统上进行cDNA扩增，并配以合适的引物。GAPDH作为基准用于标准化相关基因表达。

1.6 免疫蛋白印迹实验 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞，制备细胞总裂解蛋白。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜放在5%脱脂牛奶中37 ℃封闭1 h，然后与一抗UHRF1(Abcam，Cambridge，MA，USA)、PCNA及Bax(Cell signaling technology，Danvers，MA，USA)和GAPDH 4 ℃孵育过夜。室温用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗将上述膜孵育1 h。最后，用免疫印迹化学发光底物(Thermo Fisher Scientific，Inc.)构建蛋白条带。采用Image-Pro Plus 6.0软件对蛋白条带进行分析。

1.7 γH2xa染色 将A549细胞接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中。miR-144 mimic及其对应的NC 转染48 h。将Ki67抗体以及γH2ax(Cell signaling technology，USA)抗体室温孵育1 h后，加入相应的荧光显色剂室温孵育20 min。DIPA染细胞核5 min。免疫荧光显微镜进行相应的细胞拍摄。

1.8 吖啶橙/溴化乙锭荧光染色 A549细胞用吖啶橙/溴化乙锭混合液(1∶1)孵育5 min(索莱宝生物技术公司，中国)。用荧光显微镜(200×)观察细胞形态变化。凋亡细胞百分比的计算公式如下：凋亡率(%)=凋亡细胞数/所有计数细胞数。

2 结果

2.1 miR-144以及UHRF1在NSCLC患者组织中的表达 TCGA数据库中miR-144在NSCLC患者癌与癌旁标本中明显低于癌旁(图1A)。高表达miR-144组的NSCLC患者生存率明显高于低表达miR-144组(图1B)。同时，TCGA数据库中UHRF1在NSCLC患者癌与癌旁标本中，在不同人种、不同性别、不同年龄以及是否有吸烟史，明显高于癌旁组织(图1C～图1G)。且高表达UHRF1 对于NSCLC患者生存率明显低于低表达UHRF1组(图1H)。同时，miR-144与UHRF1在NSCLC患者中表达呈负相关(图1I)。

2.2 miR-144对于A549细胞活性的影响 qRT-PCR检测miR-144在A549细胞中的转染效率；miR-144 mimic组中miR-144表达明显高于NC组(图2A)。CCK-8结果表明，低表达miR-144能够明显促进A549的活性，而高表达miR-144抑制A549细胞的活性(图2B)。Ki67结果显示，过表达miR-144能够明显抑制A549活性(图2C)。γH2a染色结果表明，过表达miR-144组中γH2a表达明显高于NC组(图2D)。Western blot结果显示，过表达miR-144后，PCNA以及Bax蛋白相对于NC组明显下调，Bcl-2蛋白明显上调(图2E)。

2.3 UHRF1是miR-144的靶基因 为研究miR-144调节NSCLC细胞活性的作用机制，分析与miR-144有结合位点的潜在靶基因。结果显示，UHRF1 3′端与miR-144有结合位点(图3A)。通过荧光素酶检测实验确定miR-144是否直接结合UHRF1的3′端非编码区。结果显示，过表达miR-144明显降低了UHRF1-WT的荧光素酶活性；而UHRF1-Mut阻断了miR-144的调节作用(图3B)。为验证A549细胞中UHRF1是否为miR-144的直接靶点，我们通过qRT-PCR和Western blot检测了转染miR-144类似物组或抑制剂后，A549细胞中UHRF1有表达。qRT-PCR显示，miR-144类似物显著下调了UHRF1 mRNA的表达，而miR-144抑制剂上调了其表达(图3C)。Western blot检测到转染了miR-144类似物的细胞中UHRF1蛋白表达水平下降，而miR-144抑制剂显著增加了UHRF1蛋白表达(图3D)。

图1 miR-144以及UHRF1在NSCLC患者中表达及对预后的影响

注：A.miR-144在肺癌患者中的表达；B.不同表达的miR-144对于肺癌患者生存率的影响；C～G.UHRF1对不同人种、性别、年龄及吸烟史NSCLC患者的影响；H.UHRF1在NSCLC患者生存率；I.miR-144与UHRF1在NSCLC患者中的表达

图2 miR-144对A549细胞活性的影响

A.qRT-PCR检测转染miR-144转染效率；B.CCK-8检测不同表达的miR-144对于A549细胞的活性影响；C.AO/EB染色过表达miR-144后对A549细胞凋亡能力的影响；D.γH2a染色检测过表达miR-144对A549细胞的DNA损伤的能力；E.Western blot 检测过表达miR-144对A549细胞中PCNA、Bcl-2及Bax蛋白的变化。*P<0.05

3 讨论

miR-144在多种癌症中存在差异表达。miRNA深度测序分析显示，过表达miR-144能够抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭性以及提高化疗耐药性[9]。miR-144能够通过靶向增强子结合蛋白4抑制前列腺癌细胞增殖[10]。此外，最近研究显示，miR-144通过下调Smad4抑制结肠癌的生长和转移[11]，表明miR-144作为一个抑癌基因，参与肿瘤的病理生理过程。本研究结果表明，miR-144在NSCLC中表达下调，过表达miR-144抑制了NSCLC细胞的生长，且低表达miR-144 NSCLC患者生存率较高。结果表明，miR-144对肿瘤具有抑制作用。

有报道，γ-H2ax被ATM磷酸化，以进一步招募BRCA1和TP53bp1等，并在DNA断裂位点周围形成支架[12]。然后，ATM/ATR激酶将DNA损伤信号转导到下游通路，如细胞周期、DNA修复或凋亡[13]。miRNA能够调控γ-H2ax表达进而影响细胞凋亡[14]。本研究结果表明，过表达miR-144能够诱导A549细胞中γ-H2ax表达升高，导致DNA损伤诱导细胞凋亡。

图3 UHRF1是miR-144的靶基因

综上所述，本研究证实了miR-144在NSCLC中具有抑癌作用。功能性研究表明，miR-144通过靶向UHRF1调控γ-H2ax表达，进而抑制NSCLC活性，诱导细胞凋亡。因此，miR-144/UHRF1通路可能为治疗NSCLC提供新的潜在治疗方法。