异甘草素抗肿瘤作用及其机制研究进展

石玉花，李瑞萍，陈小芸，杨 艳，郭钰珍

0 引言

异甘草素(Isoliquiritigenin，ISL)，又名2,2,4-三羟基查耳酮，是从豆科植物甘草、胀果甘草以及光果甘草根茎中提取的黄酮类化合物，其分子式为C15H12O4。近年来，关于异甘草素的药理作用研究成为热点，研究发现，异甘草素在抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗病毒、治疗心律失常以及保肝等方面有重要作用。

国内外众多研究显示，异甘草素对神经胶质瘤[1-5]、口腔癌[6-8]、肺癌[9-13]、乳腺癌[14-19]、肝癌[20]、胃癌[21-22]、胰腺癌[23]、结直肠癌[24-26]、肾癌[27]、膀胱癌[28]、前列腺癌[29]以及女性常见的卵巢癌[30-33]、子宫内膜癌[34]和宫颈癌[35-36]等均表现出良好的抗癌活性，其抗癌机制为多类型的，可以从癌细胞的形成、增殖、迁移以及诱导凋亡等多个方面发挥抗癌作用，本文就异甘草素的抗肿瘤作用及可能的机制研究进展进行综述，为异甘草素的深入研究和抗肿瘤新药的开发提供依据。

1 阻滞细胞分裂周期，诱导细胞凋亡

Hsia等[7]在研究ISL对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)的抗癌作用时，发现ISL可诱导OSCC细胞周期G2/M期阻滞、细胞凋亡和DNA损伤。DNA修复相关的毛细血管扩张共济失调突变基因(ATM)和磷酸化ATM也被下调，认为ATM被ISL激活的caspase分解，从而抑制OSCC细胞中的DNA修复，引起OSCC 的凋亡。陈利军等[37]探讨ISL对人食管鳞癌细胞系EC9706和 KYSE450的影响及其作用机制时，发现ISL抑制食管鳞癌细胞EC9706与KYSE450的增殖与其剂量呈正比例关系，ISL还可将此两种细胞周期阻滞在G2/M 期，诱导其发生凋亡，并且显著下调细胞中 IGF-1R表达，抑制下游PI3K/AKT和 RAS/MAPK信号通路的激活，从而发挥抗食管癌活性。Zhou等[12]的研究结果表明，含有ISL的活性提取物可上调组织中p53、p21、促凋亡成员Bax、Bid蛋白的表达和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并通过增加启动子caspase-8和caspase-9的酶活性来激活效应子caspase-3和caspase-7，导致内在细胞凋亡蛋白酶级联激活，从而引起非小细胞肺癌A549细胞凋亡。

Si等[28]发现，ISL在体外诱导人膀胱癌T24细胞凋亡的机制可能与细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)活性升高、线粒体膜电位下调和caspase-3/caspase-9介导的线粒体凋亡信号通路激活有关。Zhang等[29]研究ISL在人前列腺癌PC-3和22RV1细胞中的抗癌功效和相关机制时，发现ISL可在体外引起G2/M细胞周期停滞，并抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。其使用微阵列转录分析来鉴定前列腺癌PC-3细胞上的ISL调节基因。经过ISL处理后，参与细胞周期、DNA损伤和凋亡信号通路的多个基因发生了显著变化。分子研究显示，G2/M阻滞与细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和磷酸化CDK1(Thr14，Tyr15和Thr161)的减少有关，同时与14-3-3sigma的表达增加和DNA损伤诱导的45α(GADD45A)增加有关。此外，研究者用较高浓度ISL处理诱导细胞凋亡，发现其主要与增强凋亡调节因子(Bax/Bcl-2)的比例有关。结果表明，ISL调节细胞周期蛋白B1与CDK1使得细胞于G2/M期停滞，并增强凋亡因子诱导癌细胞的凋亡。Chen等[31]研究ISL对人卵巢癌的抗肿瘤作用时，通过流式细胞术分析，表明ISL诱导卵巢癌OVCAR5细胞G2/M期阻滞。Wu等[34]研究表明，ISL处理人子宫内膜癌细胞系(Ishikawa，HEC-1A和RL95-2细胞)后，可诱导癌细胞停滞于G1或G2/M期，从而抑制癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。Hirchaud等[35]研究ISL对人类宫颈癌细胞Ca Ski、SiHa、HeLa和C-33A的抗增殖和凋亡活性时，发现ISL可以降低癌细胞活力、诱导G2/M期细胞积聚和4种癌细胞发生凋亡的形态改变。在Ca Ski细胞中，ISL导致HPV16 E6、Bcl-2表达下调，而p53、p21和Bax表达增强，Bid触发线粒体膜电位消散，使其释放细胞色素C至细胞质后激活半胱天冬酶级联反应，裂解caspase-9、caspase-3、caspase-8和PARP，引起宫颈癌细胞的凋亡。以上发现拓宽了对ISL介导的细胞凋亡分子基础的理解。

2 诱导肿瘤细胞发生自噬

Wang等[15]研究表明，ISL可增强阿霉素耐药的人乳腺癌MCF-7/ADR细胞的化疗敏感性，并诱导细胞发生自噬。Jin等[26]研究ISL在结直肠癌(CRC)细胞中的抗癌机制时，发现 ISL可诱导人HCT-116细胞凋亡并引起p62/SQSTM1 mRNA和蛋白的表达，p62/SQSTM1是与自噬相关的最常见的标志物。结果表明，ISL诱导p62/SQSTM1上调从而减弱CRC细胞中胱天蛋白酶-8活化而影响ISL介导的癌细胞凋亡。张栋栋等[32]的研究发现，ISL对人卵巢癌SKOV3细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用，其抗体外肿瘤机制可能与激活线粒体凋亡通路及自噬通路相关。Yushan等[38]在探索ISL对鼠肉瘤S180细胞的作用机制时，发现ISL不能直接体外抑制S180的生长，但是可抑制体内S180肿瘤细胞的体积。NK细胞中的TNF-α被siRNA敲除时，ISL对S180肿瘤没有抑制作用。通过FCM检测发现，ISL可增强NK细胞中TNF-α的表达，自噬相关蛋白LC3-II、Beclin-1、ATG-7在与ISL处理的NK细胞共培养的S180细胞中升高。当TNF-α被siRNA敲低时，ISL不能在S180肿瘤中诱导自噬。在骨肉瘤患者的NK细胞中，通过ELISA检测，TNF-α与GSK-3β呈负相关，ISL可以抑制GSK-3β的表达，并进一步增加NK细胞中p65和c-Rel的表达，但当细胞中的GSK-3β被siRNA敲除时，ISL并不影响p65和c-Rel的表达。这是因为ISL可以直接抑制GSK-3β，然后激活NF-κB通路，增强NK细胞中TNF-α的表达，从而诱导肉瘤自噬。Yang等[39]研究发现，ISL也可诱导嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)发生自噬，达到治疗嗜铬细胞瘤的作用。Yang等[40]研究发现，ISL可诱导自噬引起人表皮黑色素细胞退化，从而治疗黑色素瘤，其作用与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

3 抑制肿瘤细胞的转移

Dang等[2]研究发现，ISL可能通过下调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达来抑制细胞神经胶质瘤干细胞迁移和侵袭，从而发挥抗肿瘤作用。Hu等[6]研究发现，ISL可以抑制口腔鳞状细胞癌干细胞(OSCC-CSCs)侵袭、转移和生长为集落的能力，并且能够增强化疗药物对口腔鳞状细胞癌的敏感性。Chen等[10]研究发现，ISL介导的肺癌细胞转移抑制作用是由细胞骨架重组和黏着斑组装受损引起的，是因为ISL代谢产物干扰了Src激酶。Wang等[17]研究ISL对巨噬细胞M2表型极化的调控作用时，发现ISL可以逆转M2表型巨噬细胞的极化，并通过提高 miR155表达和抑制 STAT3/6 信号通路活化，从而影响精氨酸酶 1(Arg-1)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和血红素加氧酶 1(HO-1)的表达，达到抑制M2巨噬细胞对乳腺癌细胞转移的促进作用。

4 抑制肿瘤细胞的发生

乳腺癌干细胞(CSCs)是乳腺肿瘤发生的根源。Wang等[16]研究发现，ISL可以减少CSCs群，抑制体内乳腺癌的发生和发展。其通过全局基因表达谱测定法鉴定了WIF1为ISL治疗的主要应答基因，可引起β-连环蛋白信号传导的下调和乳腺CSCs中的G0/G1期阻滞。并用甲基化分析进一步揭示了ISL通过促进其启动子的去甲基化来增强WIF1基因表达，这与DNMT1甲基转移酶的抑制密切相关，分子对接分析显示，ISL可以稳定地进入DNMT1的催化结构域。以上研究证明，ISL可以作为膳食补充剂用于抑制乳腺癌的发生。刘方康等[22]研究表明，ISL通过诱导分化和抑制增殖对人神经胶质细胞瘤干细胞(GSCs)具有抗肿瘤作用。Zhao等[25]认为，M2巨噬细胞极化与结直肠癌的发展有关，他们以氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎相关肿瘤发生的小鼠为模型，发现通过ISL下调PGE2和IL-6信号传导限制了M2巨噬细胞的极化，有效抑制了结肠炎相关的肿瘤发生。

5 引起肿瘤细胞凋亡作用

有研究认为，ROS可通过外在细胞死亡受体和内在线粒体细胞死亡途径引起细胞凋亡[41]，因此，ROS形成增加和随后诱导细胞凋亡是一种治疗癌症的新方法[42]。Hou等[8]在研究ISL抑制舌鳞癌细胞Tca8113的增殖实验中，用荧光显微镜检测细胞内ROS时发现ROS降低。说明ISL抑制Tca8113的增殖、黏附、转移以及促进其凋亡的作用可能与抗氧化有关。而Kim等[27,41]的研究认为，ISL通过使细胞产生ROS诱导肾癌Caki细胞和嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)凋亡，其机制分别可能与诱导p53的产生、抑制STAT3信号通路和引起线粒体-细胞色素C-caspase蛋白酶内在机制的激活有关。阎新燕等[43]的研究中，ISL能够抑制人黑色素瘤A375细胞的恶性增殖，最终诱导细胞凋亡，推测其作用机制可能是ISL通过引起活性氧升高、线粒体膜电势下降，从而影响 A375 细胞的糖酵解途径而导致细胞凋亡。所以在ISL是减低细胞中活性氧还是增加细胞中活性氧的产生从而引起肿瘤细胞的凋亡这一机制上需要进一步的研究。

6 多种机制的抗肿瘤作用

Tian等[9]在探究ISL抑制肺癌A549细胞增殖和迁移的分子机制时，发现ISL显著下调A549细胞中E-钙黏蛋白的表达，并上调N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。流式细胞术分析显示。ISL处理A549细胞后凋亡显著增加，促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白和活性caspase-3的表达增加，抗凋亡蛋白表达降低。ISL处理的细胞中，磷酸化AKT和雷帕霉素靶点蛋白表达水平降低，细胞增殖蛋白P70和细胞周期蛋白D1的表达显著降低。由此得出ISL对A549细胞的增殖和迁移具有显著的抑制作用，并且可诱导肺癌细胞的凋亡。该机制可能涉及A549细胞中的PI3K/AKT信号传导途径，其可能是治疗肺癌的潜在治疗靶标。Zhang等[21]研究了ISL对MKN28胃癌细胞的作用和潜在机制，发现ISL可能通过抑制磷酸肌醇3激酶/AKT/mTOR(PI3K-AKT-mTOR)信号通路，影响MKN28细胞的凋亡、自噬、增殖、迁移和侵袭。Li等[30]观察到ISL对卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞的迁移、侵袭有明显的抑制作用，并可诱导这两种细胞的凋亡。实验发现，ISL处理增加了SKOV3和OVCAR3细胞中Bax/Bcl-2的比率，表明线粒体凋亡途径被触发。他们还观察到用ISL处理细胞后，Akt和mTOR的磷酸化形式减少，GSK3β的表达增加，而P70/S6K减少。ISL还通过降低Ishikawa和ES-2细胞中p-Akt、p-mTOR、P70/S6K和细胞周期蛋白D1的表达水平来抑制PI3K/Akt/mTOR途径。这些结果表明，ISL通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的增殖和侵袭，并诱导SKOV3和OVCAR3细胞的凋亡。Chen等[44]的研究也发现，ISL可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，延缓骨肉瘤U2OS细胞的增殖并促进细胞凋亡。

7 其他途径抗肿瘤作用

现有的理论认为，非小细胞肺癌(NSCLC)的发生与多种遗传改变相关，包括表皮生长因子受体(EGFR)的突变。Jung等[11]在体外测定激酶结果，发现ISL可以抑制野生型和双突变体(L858R/T790M)EGFR的催化活性。ISL还降低了NSCLC细胞中Akt和ERK1/2的磷酸化，并减弱了Akt1和ERK2的激酶活性。ISL通过与EGFR及其下游信号激酶Akt1和细胞外信号调节激酶(ERK)1/2相互作用抑制其催化活性，从而抑制并诱导EGFR敏感性或EGFR耐药性肺癌细胞的凋亡。Peng等[14]认为，ISL通过降低miR-374a表达来抑制异常Akt信号传导并增加PTEN表达的途径诱导细胞凋亡负向调节乳腺癌的生长。Zheng等[18]通过流式细胞术和酶裂解检测法发现，ISL在MDA-MB-231和BT-549人乳腺癌细胞中诱导失巢凋亡，可能是通过抑制环氧合酶2(COX-2)和细胞色素P450(CYP)4A信号传导并降低乳腺癌细胞中前列腺素E2(PGE2)、20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)和磷酸-Akt[Thr(308)]的分泌来发挥抗癌作用的。Li等[20]和Zhao等[3]的研究发现，ISL可逆性抑制DNA拓扑异构酶(Top I)的活性，降低肿瘤细胞的解旋率，在诱导肝癌细胞和U87胶质瘤细胞凋亡中起重要作用。目前的研究认为，肠道菌群的失调与结肠炎相关的结直肠癌(CAC)有关，中药逐渐被用于调整肠道微生物群。Wu等[24]的研究中，使用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导CAC小鼠模型(CACM)，评估ISL对CAC发育和肠道微生物群的影响。组织病理学分析表明，ISL降低了体内肿瘤发生率。与对照小鼠(CK)中的微生物群相比，CAC小鼠发育期间，肠道中拟杆菌的水平降低，而厚壁菌门的水平增加。笔者认为，ISL逆转了菌群的不平衡，改变了肠道微生物群的家族成分。用高剂量ISL处理小鼠后，肠道中螺旋杆菌科的数量增加，而毛螺菌科和理研菌科的数量下降。在菌群属的水平上，ISL减少了机会致病菌(埃希氏菌和肠球菌)的水平，而增加了益生菌的水平，特别是产丁酸盐的菌群(丁酸梭菌、梭菌和瘤胃球菌)。因此，认为ISL保护小鼠免受AOM/DSS诱导的CAC，并且ISL和肠道微生物群具有协同的抗癌作用。

8 小结

本文基于已有的研究，综述了异甘草素抗肿瘤的作用及可能的机制，作用涉及肿瘤的发生、转移、凋亡各个过程，但都未完全明确，需要在这些可能的机制基础上进一步研究，得到更多有效的抗肿瘤靶点并明确ISL抗肿瘤的机制，且其天然、安全、经济易得，其能否应用于肿瘤的辅助治疗，需要我们更多的探索。