冬虫夏草中砷的形态分析与评价

邵劲松， 胡耀娟， 刘苏莉， 季正芯， 高丽英， 陈昌云*

(1.南京晓庄学院环境科学学院，江苏南京 211171;2.江苏省农产品质量检验测试中心，江苏南京 210036)

随着快速城市化和工业化的迅猛发展，大量砷进入环境中[1，2]。根据2016年中国农业土壤的调查显示，近10%的研究领域相当一部分是砷和重金属污染[3]。土壤中砷浓度过高会影响作物生长，最终危害到人类健康和生态系统安全。冬虫夏草作为我国传统的名贵中药材，具有免疫调节，抗肿瘤，补肾益肺，止血化痰等功效[4]。2016年，食药监局叫停冬虫夏草用于保健品的试点工作，对部分虫草及相关系列产品的检测表明，其砷含量可能超出保健食品国家安全标准限定值，长时间食用存在一定风险。

不同形态的砷化合物毒性相差甚远[5，6]。以无机砷毒性最大，有机砷的毒性较弱。目前所知的食药材中以二甲基砷(DMA)、一甲基砷(MMA)、砷胆碱(AsC)和砷甜菜碱(AsB)等形式存在[7，8]。因此，单以砷总量来衡量整体毒性是不全面的，还应考察不同形态的毒性。针对砷形态分析技术，目前国内已有成熟的方法[9 - 12]。曹晓刚等[13]建立了高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)法同时测定西藏冬虫夏草中的四种砷形态，但该文分析冬虫夏草时并未对片剂、胶囊不同剂型，虫部、草部不同部位的砷形态进行比较与评价。事实上剂型不同、部位不同，药效和砷含量也不尽相同，因此，有必要对此进行详细考察与评价。

本文采用响应面优化法对实验条件进行了系统地优化，采用HPLC-HG-AFS联用技术，建立了冬虫夏草产品中不同砷形态化合物含量的检测方法，并详细分析比较了虫草不同部位以及生药与不同剂型的熟药之间的含砷量，为冬虫夏草的食用安全性评价提供了更加可靠的科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

SAP 20-SA 20高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用仪(北京吉天仪器有限公司)；TG16-WS台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；SHA-C水浴恒温震荡器(金坛市恒丰仪器制造有限公司)；FD115电热恒温干燥箱(BINDER)；AB304-S电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；pHS -3C酸度计(上海精密科学仪器有限公司)；真空抽滤装置。

砷标准溶液(1 000 mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；砷酸根As(Ⅴ)、亚砷酸根As(Ⅲ)、二甲基砷(DMA)、一甲基砷(MMA)标准物质(以As计分别为：17.5±0.4 μg/g、75.7±1.2 μg/g、52.9±1.8 μg/g、25.1±0.8 μg/g，中国计量科学研究院)。总砷工作标液配制：将1 mg/L的砷标准液逐渐稀释浓度为10、20、40、60、80、100 μg/L的标准系列溶液。四种砷形态工作标液配制：将5 mg/L四种砷形态的标准储备液逐渐稀释质量浓度为20、40、60、80、100 μg/L的标准系列溶液。KBH4(分析纯，天津市化学试剂研究所)；(NH4)2HPO4(分析纯，西陇化工股份有限公司)；KOH、HNO3(均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；纯水为实验室自制。

1.2 仪器参数条件

HPLC-HG-AFS的仪器条件：阴离子交换柱Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm i.d.，10 μm)；流动相：15 mmol/L (NH4)2HPO4溶液(pH=6)；流速：1.0 mL/min；进样体积100 μL；还原剂：0.35% KOH+2%KBH4溶液；载流：7%HNO3；负高压：310 V；总电流：100 mA；辅电流：50 mA；载气流量：400 mL/min；屏蔽气流量600 mL/min；炉高8 mm；蠕动泵速65 r/min。

AFS -930双道原子荧光光度计的仪器条件：光电倍增管负高压290 V；灯电流60 mA；原子化器温度200 ℃；炉高8 mm；载气流速400 mL/min；屏蔽气流速800 mL/min；进样体积1 mL。

1.3 样品前处理

称取样品0.05 g于50 mL离心管中。加入10 mL 1.2 mol/L HNO3，浸提过夜。70 ℃水浴锅恒温2.5 h，每隔半小时振荡1 min。冷却后，以8 000 r/min高速离心15 min，取上层清液0.45 μm滤膜过滤，待测，按相同方法做空白实验。

1.4 总砷的前处理

称取样品0.05 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL HNO3，2 mL H2O2，将消解罐放入微波密闭消解系统中，设置微波消解条件于200 ℃消解10 min。待程序结束，置电热板160 ℃下加热2 h，用硫脲-抗坏血酸混合溶液定容至25 mL，混匀，静置，待测，按相同方法做空白实验。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

本文用阴离子交换柱分离各种形态砷化合物，以(NH4)2HPO4溶液为流动相，采用等度的洗脱方式。由于流动相浓度和流速的选择直接影响砷形态分离效果,最终影响样品中含量的测定，本文选取流动相浓度15 mmol/L，20 mmol/L，25 mmol/L，流速为0.8 mL/min，1.0 mL/min，1.2 mL/min进行比较。四种形态的分离度和保留时间见表1。

表1 不同流动相浓度、流速下四种砷形态峰的分离度Rs和保留时间tR

carrier gas flow:400 mL/min; shielding gas flow:600 mL/min ; negative high pressure:300 V; furnace height:8 mm; peristaltic pump speed:65 r/min.

结果显示，流动相在15 mmol/L的浓度下，四种砷形态的分离度最好，且它们的保留时间随着浓度的增大而减少。当流速越大，形态砷的分离效果越差，保留时间越来越短，这不利于形态砷的分析。综合考虑选择流动相浓度为15 mmol/L，流速选择为1 mL/min为最佳色谱条件。

2.2 原子荧光光谱条件优化

2.2.1 单因素实验结合厂家给出的相关参数值，本文选取负高压在280～320 V，炉高在6～10 mm，蠕动泵速在60～80 r/min，各选取5个值，进行单因素实验，确定最佳范围。结果显示，四种砷形态物质的峰面积均随负高压的增大而增大；炉高大于8 mm时，峰面积随之增大而减小；蠕动泵速对峰面积的影响成曲折状态。负高压大于等于300 V时，DMA峰分离度较差；随着蠕动泵速增加，组分的分离度逐渐变小。综合考虑，选择负高压为290～310 V，炉高为7～9 mm，蠕动泵速为65～75 r/min。

2.2.2 响应面的优化方法根据单因素的试验结果，用Box-Behnken响应面设计法优化负高压在290～310 V之间，炉高在7～9 mm，蠕动泵速为65～75 r/min之间，试验因素编码和水平如表2。

表2 Box-Behnken响应面设计试验因素水平和编码

根据试验因素编码和水平表安排17组实验，根据结果，以峰面积和分离度为指标建立二次多项式回归模型[13]，并做该模型的方差分析。对于峰面积而言，因素A、C对峰面积的影响极显著，B2对峰面积影响显著，其余对峰面积的影响不显著；对于分离度而言，因素A、C2对分离度的影响极显著，A2对分离度影响显著，其余对分离度的影响不显著，但其中因素B和AB对分离度的影响稍显著。为了便于对模型进行分析讨论，保留了不显著项。

2.2.3 峰面积下两因素的交互作用分析由峰面积和峰分离度之间的二次多项式模型的方程做两因素间的等高线图和响应面图，各因素及两因素间的交互作用可以通过组图[14]直观反映出来。图1(b)和图2(b)中，峰面积随负高压增加而增加，响应曲面图的陡峭表明负高压变化对峰面积的影响达极显著水平；图1(b)和图3(b)中，蠕动泵速对峰面积的影响趋势不明显，表明蠕动泵速变化对峰面积的影响不显著；图2(b)和图3(b)中，随着炉高的增加，峰面积成下降趋势，降幅较小，响应曲面图陡峭程度一般，说明炉高变化对峰面积的影响达显著水平[15]。由此确定三种因素变化对峰面积影响的显著程度为：负高压>炉高>蠕动泵速，这与方差分析结果一致。图3(a)等高线成椭圆形，说明蠕动泵速和炉高的交互作用相对于与负高压之间的交互作用稍强。在炉高为8 mm时，蠕动泵速对峰面积的影响相对显著。图1(a)和图2(a)的两因素交互作用不明显，可能是负高压对峰面积影响较大，而炉高与蠕动泵速对峰面积影响偏小造成。综上，本文选择负高压为310 V，炉高为8 mm。

图1 负高压和蠕动泵速对As(Ⅲ)峰面积影响的等高线图(a)和响应面图(b)Fig.1 Contonr plot (a)and response surface (b)showing the negative high voltage and peristaltic pump speed on the peak area of As(Ⅲ)

图2 负高压和炉高对As(Ⅲ)峰面积影响的等高线图(a)和响应面图(b)Fig.2 Contonr plot (a)and response surface (b)showing the Negative high pressure and furnace height on the peak area of As(Ⅲ)

图3 蠕动泵速和炉高对As(Ⅲ)峰面积影响的等高线图(a)和响应面图(b)Fig.3 Contonr plot (a)and response surface (b)showing the peristaltic pump speed and furnace height on the peak area of As(Ⅲ)

2.2.4 分离度下两因素的交互作用分析当蠕动泵速较快、炉高较高时，随着负高压的增加，分离度变小，而蠕动泵速较慢、炉高较低时，随着负高压的增加，分离度先减小后增大。负高压对分离度的影响较明显。随着炉高的增加，分离度先减小后增大。蠕动泵速对分离度的影响不大。炉高和蠕动泵速对分离度的影响均不明显，说明两因素对分离度显著性差。得出三因素变化对分离度影响的显著程度为：负高压>蠕动泵速>炉高，与方差分析结果一致。

结合对峰面积的分析，综合选择负高压310 V，炉高8 mm，蠕动泵速65 r/min。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系和检出限在0～100 μg/L的范围内，配制的0、20、40、60、80、100 μg/L四种砷形态化合物的混合标准溶液，以峰面积S对浓度c拟合标准曲线。根据载入基线计算得出砷形态的检出限，具体见表3。

表3 线性关系与检出限

2.3.2 回收率和精密度本文对冬虫夏草样品中虫部进行了四种砷形态的低、中、高三水平进行加标回收实验，每个水平重复6次，冬虫夏草虫部样品回收率和精密度的测定结果如表4所示。

表4 冬虫夏草中虫部的四种砷形态的回收率和精密度(n=6)

(续表4)

Arsenic formBackground value(μg)Added(μg)Measured(μg)RSD(%)Recovery(%)0.12000.10611.988.4MMA00.08000.06824.285.30.10000.08983.589.80.12000.11452.495.4As(V)00.08000.06983.887.20.10000.09232.592.30.12000.12071.1100.6

2.3.3 稳定性考察实验中发现，当水浴温度为90 ℃时，会造成As(Ⅲ)迅速降解，因此前处理温度不宜过高，经处理过后的样品应置于4 ℃下保存且不超过48 h，否则容易造成As(Ⅲ)降解，影响测定结果。

2.3.4 实际样品测定分别对虫部(药店市售)，草部(药店市售)，虫部(青海玉树)，草部(青海玉树)，片剂，胶囊样品进行砷的四种形态分析，结果发现生药中均只有As(Ⅲ)被检测出来且含量较高，DMA，MMA，As(V)均未检测出；熟药中四种砷形态均未检出。说明样品中总砷主要以无机砷形态存在。虫部的砷含量明显大于草部砷含量，片剂和胶囊则未检出，检测结果如表5所示。

表5 冬虫夏草中砷形态检测结果

3 结论

本文采用Box-Behnken响应面设计法来优化原子荧光光谱的仪器条件，建立了HPLC-HG -AFS测定冬虫夏草中的四种砷形态的方法。针对本文研究的冬虫夏草，生药样品均能检测出As(Ⅲ)，其砷含量超过《中国药典》2015年版对药材及其制剂的要求(重金属As残留量≤2.0 mg/kg)，熟药样品，包括市售的胶囊和片剂均未检测出。通过与总砷的比较发现，样品中存在四种价态以外的砷形态。