右归丸通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对膝骨关节炎模型鼠软骨组织保护作用的研究

颜春鲁 李盛华 安方玉* 孙仕华 刘永琦,2 蔺兴遥,2 张艳霞 杨译 马正民 牛彦强

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2. 敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000 3. 甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000 4. 兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730000

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见于中老年人群的慢性关节退行性疾病，以关节软骨的退变为主要病理特征[1-2]。在OA的发病中，以膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)最为常见。KOA是一种以膝骨关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生为特征的慢性关节炎疾病[3]。近年来人们对 KOA的防治逐渐聚焦于关节软骨。有研究证实，减少基质金属蛋白酶和一些炎症因子的分泌可以抑制KOA的炎症反应，从而缓解关节软骨的退变[4]。也有研究发现，mTOR具有调控KOA关节软骨退变的作用[5]。同时发现，自噬相关蛋白Beclin1、LC3在正常软骨中稳定表达，而在退变的软骨(OA)中 Beclin1、LC3的表达是降低的[6]。因此，mTOR和Beclin1可能成为OA 治疗的新靶点，通过抑制mTOR的表达和增强Beclin1 的表达，有可能保护关节软骨的完整性和延缓关节软骨的退变，进而探索出一种防治骨关节炎的新疗法。我们采用改良Hulth法制备KOA模型大鼠，通过观察右归丸对KOA模型大鼠炎症细胞因子、基质金属蛋白酶和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein Kinase B，Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路的相关因子表达的影响，探讨右归丸防治KOA的分子机理，为右归丸的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物：选取SPF级4～6月龄SD大鼠60只，雌雄各半，体重(180±20)g，购自我校科研实验动物饲养中心。动物质量合格证号：SYXK(甘)2015-0005。

1.1.2试剂与药物：水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20150105)；反转录试剂2×prime script RT master mix(大连宝生物工程有限公司，批号： AI20 775 A)； 荧光定量SYBR P Remix EX TaqⅡ(美国Promega公司，批号为：0000304040)；GAPDH抗体(Immuno Way，批号：B4501)； Rabit Anti-PI3K Polyclonal Antibody(Abcam，批号：GR3192684-3)；Rabit Anti-pAkt Polyclonal Antibody(Gene Tex，批号：821801334)；Rabit Anti-pmTOR Polyclonal Antibody(Immuno Way，批号：B1107)；Rabit Anti-Beclin1 Polyclonal Antibody(Gene Tex，批号：821801315)；右归丸(仲景宛西制药股份有限公司，国药准字Z41022170，批号：151108)；硫酸氨基葡萄糖片(保节力，新兴同仁药业有限公司，国药准字H20041317，批号：160302)；青霉素(河北制药股份有限公司，国药准字：H13020657，批号：F6042103)。

1.1.3仪器：BioMATE 3S型蛋白、核酸浓度测定仪(Thermo公司)；ChemiDocTMXRS+

型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；BX53型显微镜(日本OLYMPUS公司)；ZY12306型微量加样器(ScienTiFic产品)；C1000型PCR热循环仪(美国ABI公司)；LightCycler 96型 Real Time PCR System(美国罗氏公司)；TGL16 M型台式高速冷冻离心机(凯达集团成员高科技公司)；OSE-Y10型电动组织研磨器(上海Tiangen 公司)。

1.2 方法

1.2.1实验药物的给药剂量：右归丸的临床用量为27 g/d，以人与大鼠的体表面积换算法所得的右归丸剂量(27 g×0.018×5≈2.4 g/kg)作为实验的中剂量。则右归丸高、中、低剂量分别为4.8、2.4、1.2 g/kg。

1.2.2动物分组、造模及给药：60 只 4～6月龄的SD 大鼠饲养 1 周后，随机分为假手术组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组、右归丸高剂量组、右归丸中剂量组和右归丸低剂量组，每组10只。参照文献[7-8]，模型组及干预组采用改良Hulth 法复制KOA模型。腹腔注射10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉各组动物，无菌条件下纵向切开双侧膝关节内侧，切口约长2 cm，逐层分离并暴露关节腔，剔除膝前后交叉韧带、内侧副韧带及内侧半月板，注意关节软骨面勿损伤。用洁净的5 mL注射器吸取生理盐水冲洗关节腔3～5次，行抽屉试验阳性后彻底止血，逐层缝合。假手术组 SD 大鼠从膝关节内侧只打开关节腔，不破坏韧带和半月板，并保留关节软骨面。术后连续 3 d肌肉注射青霉素 20 万U/d，各组大鼠均在相同条件下，自由饮水，摄食。手术造模 6 周后，HE染色法观察假手术组和模型组关节软骨的病理形态学改变，以关节软骨边缘严重破坏，软骨细胞排列紊乱作为模型制备成功的标志。将造模成功的动物给予药物干预，硫酸氨基葡萄糖组灌服硫酸氨基葡萄糖(0.17 g/kg)，右归丸高、中、低剂量组分别按 4.8、2.4、1.2 g/kg灌服相应的药物，干预 8周。股动脉采血处死各组动物，摘取双侧膝关节，左侧膝关节固定于4 %多聚甲醛，右侧膝关节于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3指标测定：①HE染色观察软骨的形态改变：将固定于4%多聚甲醛的左侧膝关节进行脱钙处理后，采用石蜡包埋法制作蜡块，并用切片机切片，切片厚度约5 μm，HE 染色，封片、镜检并进行 Mankin 评分，具体评分标准参考文献[9]进行。②软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表达测定：用 RNA抽提试剂提取软骨组织RNA，BioMATE 3S型蛋白、核酸浓度测定仪测定 RNA 含量。用Promega 试剂盒说明书步骤合成 cDNA 第一链，按Promega实时荧光定量试剂盒操作说明书进行 PCR 反应，反应条件：预变性 95 ℃、2 min， 变性 95 ℃、15 s，退火 58 ℃、45 s，延伸 60 ℃、 1 min，共 45 个循环。每个样品各重复 3 次，数据经 2-ΔΔCt处理后进行IL-1β、MMP-3和MMP-13基因相对表达量分析。③软骨组织PI3K、pAkt、pmTOR和 Beclin1的蛋白表达测定：软骨组织蛋白质的提取用 RIPA 裂解液，蛋白质含量的测定用BCA 法，并调整点样的蛋白质浓度为50 μg /10 μL，10 μL/每孔，作SDS-PAGE、转膜、封闭、滴加抗Rabit Anti-PI3K Polyclonal Antibody、Rabit Anti-pAkt Polyclonal Antibody、Rabit Anti-pmTOR Polyclonal Antibody和Rabit Anti-Beclin1 Polyclonal Antibody 等抗体孵育过夜，滴加山羊抗兔IgG二抗孵育。将ECL Plus 超敏发光液的A 和 B溶液等体积混匀后滴加于二抗孵育过的PVDF膜上，暗室放置 1 min后置于 Image Lab 3.0 进行曝光(单个曝光时间10 s，总曝光时间60 s)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 膝关节软骨组织形态学变化

采用HE染色法对各组动物的软骨形态学改变进行了观察，结果显示：假手术组大鼠关节面光滑平整，滑膜结构完整，软骨细胞呈水平排列；模型组大鼠关节软骨边缘严重破坏，软骨细胞排列紊乱；右归丸低、中剂量组关节软骨边缘不平整，软骨细胞排列紊乱；右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠软骨结构趋于正常，软骨细胞分布偶见不均，关节软骨表面欠光滑。Mankin评分结果显示：模型组大鼠Mankin评分较假手术组升高(P<0.01)；右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠Mankin评分较模型组均降低(P<0.05或P<0.01)。见表1和图1。

组别Makin score假手术组0.200±0.089模型组4.920±0.539##硫酸氨基葡萄糖组 2.760±0.317**右归丸高剂量组 3.050±0.253*右归丸中剂量组4.140±0.159右归丸低剂量组4.380±0.621

注：与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.05。

2.2 对软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13基因表达的影响

图1 各组动物软骨组织的病理形态改变(HE，200×)注：A假手术组；B 模型组；C 硫酸氨基葡萄糖组；D 右归丸高剂量组；Fig.1 The pathomorphological changes of the cartilage in each group(HE，200×)E 右归丸中剂量组；F 右归丸低剂量组。

模型组大鼠软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表达较假手术组显著升高(P<0.01)；右归丸各干预组和硫酸氨基葡萄糖组IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表达较模型组均显著降低(P<0.01)。见表2。

组别IL-1β(2-ΔΔCt)MMP-3(2-ΔΔCt)MMP-13(2-ΔΔCt)假手术组1.00±0.091.00±0.091.00±0.03模型组7.50±0.23##5.57±0.04##6.18±0.01##硫酸氨基葡萄糖组3.86±0.11**1.27±0.08**2.74±0.06**右归丸高剂量组2.56±0.35**1.12±0.10**2.53±0.06**右归丸中剂量组4.71±0.15**2.44±0.03**3.18±0.04**右归丸低剂量组5.32±0.49**3.62±0.04**4.03±0.09**

注：与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

表3 右归丸对KOA模型大鼠PI3K、pAkt、pmTOR和 Beclin1蛋白表达的影响Table 3 Effect of Yougui pill on the protein expressions of PI3K, pAkt, pmTOR, and Beclin1 in KOA

注：与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 对软骨组织PI3K、pAkt、pmTOR和Beclin1蛋白表达的影响

模型组大鼠PI3K、pAkt和pmTOR等蛋白表达较假手术组均明显升高，Beclin1的蛋白表达较假手术组明显降低(P<0.01)；右归丸各干预组和硫酸氨基葡萄糖组PI3K蛋白表达较模型组均明显降低，右归丸中、高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组pAkt和pmTOR等蛋白表达较模型组均明显降低，右归丸高剂量组和和硫酸氨基葡萄糖组Beclin1的蛋白表达较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)。见表3和图2。

图2 各组大鼠软骨组织PI3K、pAkt、pmTOR和Beclin1蛋白的表达注：A 假手术组；B 模型组；C 硫酸氨基葡萄糖组；D 右归丸高剂量组；Fig.2 Protein expressions of PI3K, pAkt, pmTOR, and Beclin1 of cartilaginous cell in each groupE 右归丸中剂量组；F 右归丸低剂量组。

3 讨论

mTOR是一种与细胞增殖、细胞生长及细胞分化密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[10]。目前已发现，以 mTOR 为交汇点的上游信号通路主要有PI3K/ Akt/mTOR 信号通路、AMPK/mTOR 信号通路和某些氨基酸对mTOR的激活通路。有研究证实，PI3K/ Akt/mTOR 信号通路主要参与调控细胞凋亡和细胞自噬[11]。目前有研究认为，KOA的发生是机体PI3K/Akt/mTOR信号通路激活的结果[12]。PI3K/Akt/mTOR信号通路激活以后，可以影响下游多种效应分子的活化状态，从而抑制细胞自噬[13]。Beclin1是 PI3K/Akt /mTOR信号通路中重要的负调控分子，Beclin-1是一种参与自噬体形成与成熟的调控蛋白质，在细胞增殖、凋亡、代谢等机制中发挥重要的调控作用，Beclin1是重要的KOA治疗靶点[14-15]。有研究[16-17]报道，Becn1和 LC3的表达在关节炎软骨细胞中是减少的，mTOR在小鼠膝关节炎的关节软骨细胞中的表达是增加的。也有研究[18]报道，OA软骨的退行性病变可能是通过抑制自噬信号通路的来调控的。在本研究中观察到，模型组PI3K、pAkt和pmTOR等的蛋白表达均明显升高， Beclin1的蛋白表达明显降低，说明PI3K 能与 mTOR 协同参加信号通路转导，以调控 KOA大鼠的细胞自噬。而给予右归丸干预后，右归丸能降低KOA模型鼠PI3K、pAkt和pmTOR等的蛋白表达，升高Beclin1的蛋白表达，这说明右归丸可能作为mTOR的负性调控因子，能促进自噬，进而阻止软骨组织的退变。

同时研究结果也发现，模型组IL-1β、MMP-3和MMP-13的表达也是增高的，说明KOA的病理演变与KOA患者机体自身分泌大量的炎症因子和基质金属蛋白酶有密切关系。这与以往的研究报道是一致的[4,19-20]。而给予右归丸干预后，右归丸能显著降低KOA模型鼠IL-1β、MMP-3和MMP-13的表达，进一步说明，右归丸可能通过抑制KOA患者的炎症反应和软骨细胞外基质的过度降解来延缓关节软骨的退变。

由于KOA 的发生、发展涉及的发病机制非常复杂，炎症因子的大量分泌导致基质金属蛋白酶的活化可能是其原因之一；自噬基因及PI3K/Akt/mTOR信号通路对KOA 发生发展的调节作用可能是另一重要原因。因此本研究针对KOA模型大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路与自噬之间关系的探讨，并通过右归丸的干预研究，试图揭示KOA 的发病机制及右归丸的干预机制，为临床治疗KOA提供新的思路。但是在本实验中，对炎症因子和基质金属蛋白酶的分泌与PI3K/Akt /mTOR信号通路的激活是否存在相关性未做研究，希望在今后的实验中做进一步的深入研究。

综上所述，通过不同浓度的右归丸干预KOA模型大鼠后发现，右归丸可以上调自噬相关因子的表达，抑制软骨细胞凋亡，促进细胞生存，延缓骨关节的退变、促进骨关节的重构，这可能是其治疗机制之一。