促红细胞生成素对老年性耳聋小鼠血清和耳蜗组织中IL-6 和IL-17表达的影响*

孙 青，秦雪梅，曹德林，李菊红，高 萍

1.复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻喉科（上海201700）；

2.上海市青浦区朱家角人民医院耳鼻喉科（上海201700）

老年性耳聋临床常见，其形成与听觉系统的衰老、遗传、高血压、高血糖、高脂血症及耳毒性药物等有关［1］。免疫、炎症介导因素对促进病变的形成有一定价值。白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17（IL-17）均为促进病变形成的重要因子。有研究显示两者高表达与老年性耳聋有关［2］。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一类能够促进机体造血功能的激素类糖蛋白分子，具有促进造血活性的生物学功能。EPO可能对促炎细胞因子的表达和分泌具有显著抑制效果［3］。近年研究显示EPO 对缺血和庆大霉素造成的毛细胞及神经细胞损伤具有保护作用［4］。基于此我们建立老年性耳聋的小鼠模型，应用EPO 进行干预，并进行对照观察，探讨其对血清和耳蜗中IL-6和IL-17的调节作用。

材料和方法

1 实验动物 实验动物均由南京大学模式动物研究所提供，选择5周龄小鼠48只，体重（20.3±5.6）g，无噪声暴露史和耳毒性药物应用史，无中耳炎病史。其中36只用于建立老年性耳聋的模型。

2 造模方法 36只小鼠采用腹腔注射的方法，依据每只小鼠的体重注射浓度为150 mg／（kg·d）的D-半乳糖溶液，共60 d，完成老年性耳聋小鼠模型的建立。

3 干预方法 将模型小鼠分为EPO 干预组（EPO 组）、生理盐水干预组（NS组）和对照组（C 组），均为12只。EPO 组应用EPO 进行干预，以1000 U／kg的浓度，腹腔注射，2次／周，共8周。NS组以等量生理盐水腹腔注射，2次／周，共8周。C 组不进行任何处理。

4 静脉血的留取 治疗结束后第2天，应用腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，用剪刀沿腹中线剪开腹部，完全暴露腹腔，将肠道、胃等器官拨开，分离腹部血管，找到下腔静脉（位于腹部较粗的蓝色血管）。将头皮针下端与5 ml注射器相连，用头皮针刺入下腔静脉靠近下端处，抽吸注射器，取2 ml静脉血，离心后分离血清，置于-80℃冰箱中冻存，备用。

5 耳蜗取材 取血后，用剪刀沿小鼠颈部剪断皮肤、肌肉和颈椎。从枕骨大孔沿头正中线依次剪开头皮层和颅骨，暴露脑组织并去除。沿着正中线将颅底剪开，用眼科剪剪断两侧颞岩部，找到听泡，分离出耳蜗。剪去耳蜗周围骨质，于盐水中冲洗血渍，置于-80℃冰箱中冻存，备用。

6 检测方法

6.1 免疫组织化学技术检测耳蜗组织中IL-6和IL-17的表达:基于术后石蜡包埋组织，切取4μm 切片后严格按实验步骤操作。IL-6和IL-17的一抗为浓缩液，购自上海煊翎生物科技有限公司，二抗和DAB购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按不同比例稀释后行预实验，选择IL-6（1∶50）和IL-17（1∶100）的配比浓度（显色效果最佳）进行实验，检测均由同一检验师完成，减少人为误差，做好质控。结果评判:IL-6和IL-17的阳性部位为细胞质，随机观察3个显色明显的上皮细胞分布区（400倍视野），分别进行阳性率和着色强度的计分。阳性率:≤25%为1 分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。着色强度:无着色为0分，淡黄为1分，棕黄为2分，黄褐为3分。两者相加为最后得分，分值为0～7分。以≤2分为阴性，＞2分为阳性，计算阳性率。

6.2 ELISA 法检测血清中IL-6 和IL-17 的表达:严格按实验步骤操作，均由同一检验师操作，做好实验质控工作。

6.3 实时荧光定量PCR 法检测耳蜗组织中IL-6和IL-17 m RNA 的表达:基于术后新鲜冻存组织，首先提取总RNA。IL-6 引物上游:5'-AAACTGCGTACATGCGCTG-3'，下 游:5'-TACTGTGGCACCGCATCGTT-3'。IL-17 引物上游:5'-CTGCCGTGGGAACCCTAAACGCTG-3'， 下 游:5'-CTGACGTGTGTGGCACTCTT-3'。选择U6 作为内参，引物上游:5'-GGAACCAGAAAGATTAGC-3'，下游:5'-TTGGAACGCACGAATTCCG-3'。引物由苏州睿赢生物技术有限公司合成。相关试剂购自美国ABI公司。严格按说明书进行操作。反应体系:95℃5 min，循环1次；95℃、25 s，64℃、20 s，72℃、20 s，循环15次；93℃、25s，60℃、35 s，72℃、20 s，循环35次。于60℃收集信号。读取CT 值，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对水平。

7 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件进行分析，行卡方检验和方差分析（SNK 法行两两比较），以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组耳蜗组织中IL-6和IL-17表达阳性率比较 免疫组化结果显示:C 组和NS 组IL-6 和IL-17的阳性率明显高于CK 组，EPO 组IL-6和IL-17的阳性率明显低于C组和NS组，见表1。

表1 各组耳蜗组织中IL-6和IL-17表达阳性率比较［只（%）］

2 各组血清中IL-6和IL-17表达比较 ELISA结果显示:C组和NS组血清中IL-6和IL-17的表达量明显高于CK 组，EPO 组IL-6和IL-17的表达量明显低于C组和NS组，见表2。

表2 各组血清中IL-6和IL-17表达比较（mg／L）

3 各组耳蜗组织中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 表达比较 实时荧光定量PCR 结果显示:C 组和NS组血清中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 的表达量明显 高 于CK 组，EPO 组IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 的表达量明显低于C组和NS组，见表3。

表3 各组耳蜗组织中IL-6 m RNA 和IL-17 m RNA 表达比较

讨 论

老年性耳聋是衰老基础上出现的听觉系统退行性变，主要与随着年龄的增加，遗传因素或内环境稳定性下降，机体、器官、组织细胞功能和结构发生退行性改变有关。近年研究显示炎症反应可能是病变形成的重要机制［5-6］。随着机体内环境稳定的下降，机体中炎症反应增强，且抑炎介质表达极不稳定，可以引起局部耳蜗毛细胞和支持细胞逐渐减少及神经元发生退变。也有研究显示耳蜗是代谢旺盛的组织，对缺氧敏感，且底部代谢活动强于顶部，而老年人基础代谢率低，对耳蜗组织的供血供氧量低，因此可以引起局部的炎症环境增强，抑炎介质形成减少，使毛细胞的细胞膜上脂质发生过氧化，细胞通透性增强，细胞内外的物质交换紊乱，细胞自溶，听力下降［7-8］。EPO 早期主要用于促红细胞生成治疗贫血，内源性EPO 的产生主要是肾脏以低氧依赖的方式进行，当EPO 生成不足引起肾性贫血，EPO 通过促使红系祖细胞增殖和分化来调节红细胞生成，减弱局部的炎症反应［9-10］。它的抗炎和组织保护在一些自身免疫病及神经损伤方面得到关注。

本研究结果显示老年性耳聋小鼠模型血清和耳蜗组织中IL-6和IL-17的表达明显高于正常小鼠，EPO干预后IL-6和IL-17的表达明显下降，且与IL-6 m RNA 和IL-17 mRNA 表现出一致性，提示老年性耳聋小鼠耳蜗中IL-6和IL-17高表达，是病变形成的重要促进因子，其高表达是局部炎性损伤的重要标志，是机体急性免疫应答的促发剂［11-12］。EPO 对IL-6 和IL-17的表达有明确的下调作用，显示EPO 具有对抗促炎因子生成的重要作用。近年发现其具有神经保护、抗细胞凋亡、促血管形成及减弱炎症反应的作用。也有研究显示EPO 具有保持线粒体稳定，上调Bcl-2的作用，使局部细胞凋亡受到影响［13-14］。

EPO 能减少炎症因子的产生，增强抑炎因子的分泌，减少外周血中性粒细胞的数量，抑制中性粒细胞激活等［15］。本研究发现的EPO 下调IL-6和IL-17的作用为解释EPO 在应用中的抗炎作用提供了重要基础。

总之，促红细胞生成素可以减少老年性耳聋小鼠模型血清和耳蜗组织中IL-6和IL-17的表达，减少局部的炎症反应和免疫反应，对延缓病变的进展及促进病变恢复可能有一定价值。