荭草苷对APP／PS1转基因小鼠神经保护作用实验研究*

张 泽，韩 锟，贾 宁

锦州医科大学附属第一医院神经内科（锦州121001）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种发生于中老年的神经系统变性疾病。研究表明［1-3］，AD 患者脑源性神经生长因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其功能性酪氨酸激酶B（Tyrosine kinase B，Trk B）受体表达减少。BDNF 属于神经营养因子家族的成员，在神经再生的发生、发展中发挥重要作用，其作用于Trk B受体，发挥抗神经元凋亡、改善认知功能的作用。脑内大量的β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积形成的老年斑是AD特征性病理改变之一，而Aβ1-42 是老年斑的主要成分［4］。荭草苷（Orientin，Ori）是一种水溶性碳苷类黄酮化合物，为荭草、竹叶、金莲花的主要活性成分，具有抗氧化应激、抗衰老、抗炎、抗凋亡等多种神经保护作用，能够改善痴呆小鼠的认知功能［5-7］。本文以APP／PS1转基因小鼠为研究对象，研究Ori对此动物模型BDNF和Trk B受体的作用，以及对Aβ沉积的影响。

材料与方法

1 实验材料 动物:10月龄APP／PS1转基因小鼠24只，同月龄同背景C57BL／6J小鼠8 只，购自中国医科大学实验动物中心［许可证号:SYXK（辽）2012-007］。药品与试剂:荭草苷（纯度≥99%）购于成都曼思特生物科技有限公司；兔抗BDNF 抗体、兔抗TrkB受体抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；Aβ1-42 ELISA 试剂盒购于Invitrogen 公司。仪器:Morris水迷宫（安徽正华生物仪器设备有限公司）；电泳仪、凝胶成像系统（美国bio-rad公司）；紫外分光光度计（德国Biophotometer）。

2 实验方法

2.1 动物分组与处理:将APP／PS1转基因小鼠随机分成三组，即模型组（Tg组）、Ori低剂量组（Tg／Ori-L组）和Ori高剂量组（Tg／Ori-H 组），对照组（NT 组）为同月龄同背景C57BL／6J小鼠。每组小鼠8只，雌雄各半，体重（25±3）g，各组小鼠体重比较无统计学差异。给药方法:NT 组和Tg组每天给予双蒸水5 ml腹腔注射，Tg／Ori-L 组和Tg／Ori-H 组每天分别给予Ori 10、50 mg／kg 5 ml腹腔注射，均给药4周。

2.2 Morris水迷宫实验行为学检测:给药结束24 h后行Morris水迷宫实验。实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分。实验程序参照Morris等方法进行［8-9］，检测各组小鼠的空间学习记忆能力。

2.3 Western blot检测BDNF 和Trk B 受体的蛋白表达:提取各组小鼠海马的总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。40μg蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，用5%牛奶封闭，加入一抗（BDNF，1∶500；Trk B 受体，1∶500；β-actin，1∶4000）4 ℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶结合的二抗常温孵育1 h。ECL 显影，凝胶成像系统曝光，Image J软件分析。

2.4 ELISA 法检测海马区Aβ1-42水平:将各组小鼠的脑组织称重，加入8倍体积的盐酸胍裂解液研磨，室温下静置3～4 h。用反应缓冲液1∶50稀释样品后离心20 min，取上清用于可溶性Aβ1-42的测定，离心管底部沉淀再用70%甲酸溶解后离心1 h，收集上清液用于不可溶性Aβ1-42的测定。取标准品按说明书建立标准曲线。将标准品、样品各50μl分别加入微量酶标板内，立即向每孔加入50μl Aβ1-42抗体，置摇床室温孵育3 h。反复洗板4 次，室温孵育30 min。每孔加100μl染液覆盖，37 ℃孵育30 min。取出酶标板，每孔加终止液100μl，轻轻混匀，直至孔中的液体由蓝变黄。空白孔调零，30 min内在450 nm波长读取光密度（OD 值），根据曲线方程求出脑组织中Aβ1-42的浓度。

3 统计学方法 数据分析采用SPSS 13.0统计学软件进行。实验数据以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示具有统计学差异。

结 果

1 Ori改善APP／PS1转基因小鼠学习记忆能力 各组小鼠定位航行试验显示，寻找平台逃避潜伏期（图1A）及平均路程（图1B）随着测试时间的延长而逐渐缩短。与NT 组相比，Tg组小鼠逃避潜伏期和寻找平台平均路程延长（P＜0.05），经Ori治疗后均显著缩短（P＜0.05），表明APP／PS1小鼠具有明显的空间学习障碍，Ori可以改善其能力。空间探索试验结果（图2）显示，Tg组小鼠穿梭原平台所在象限次数显著减少（P＜0.05），经Ori治疗后次数均明显增加（P＜0.05），提示APP／PS1转基因小鼠的空间记忆再现能力降低，Ori可改善其能力。与Tg／Ori-L 组比较，Tg／Ori-H 组逃避潜伏期、寻找平台平均路程和穿梭原平台所在象限次数均无统计学差异（P＞0.05），说明Ori改善APP／PS1转基因小鼠的空间学习记忆能力无剂量相关性。

图1 各组小鼠寻找平台逃避潜伏期（A）和寻找平台平均路程（B）比较

图2 各组小鼠穿梭原平台所在象限次数比较

2 Ori调节APP／PS1转基因小鼠海马区BDNF和Trk B受体蛋白表达 见图3。Western blot结果显示，与NT 组比较，Tg 组小鼠海马BDNF 和TrkB受体蛋白表达减少（P＜0.05）；与Tg组相比，Tg／Ori-L组和Tg／Ori-H 组小鼠海马BDNF 和TrkB 受体蛋白表达增加（P＜0.05）；Tg／Ori-H 组小鼠海马BDNF和TrkB受体蛋白表达与Tg／Ori-L 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 Ori减轻APP／PS1转基因小鼠海马区Aβ1-42水平 见表1。ELISA 结果显示，Tg组小鼠海马区可溶性Aβ1-42含量及不可溶性Aβ1-42含量较NT 组明显增高（P＜0.05）；与Tg组比较，Tg／Ori-L 组和Tg／Ori-H 组小鼠海马区可溶性Aβ1-42含量和不可溶性Aβ1-42含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Tg／Ori-L组比较，Tg／Ori-H 组小鼠海马区可溶性和不可溶性Aβ1-42含量无统计学差异（P＞0.05）。

图3 各组小鼠海马区BDNF和Trk B受体蛋白表达比较

表1 各组小鼠海马区可溶性及不可溶性Aβ1-42含量比较（±s）

表1 各组小鼠海马区可溶性及不可溶性Aβ1-42含量比较（±s）

注:与NT 组比较，#P＜0.05；与Tg组比较，*P＜0.05

组 别 可溶性Aβ1-42（pg／mg）不可溶性Aβ1-4（ng／mg）NT 组24.05±4.98 42.06±6.98 Tg组 67.05±8.15# 112.03±11.23#Tg／Ori-L组 32.31±6.32* 76.35±6.42*Tg／Ori-H 组 39.17±9.86* 71.05±7.35*

讨 论

Ori是一种水溶性碳苷类黄酮化合物，为荭草、竹叶、金莲花的主要活性成分。研究表明［1-3］:Ori具有抗氧化应激、抗衰老、抗炎、抗凋亡、神经保护等多种生物学作用，能够改善Aβ以及噪音诱导的痴呆小鼠的认知功能。但Ori改善痴呆小鼠认知功能的机制目前尚不清楚。

BDNF／Trk B是中枢神经系统的神经保护信号通路之一，其中BDNF 广泛分布于海马、皮质和杏仁核等区域［10］，通过与细胞膜上的Trk B 受体特异性结合而激活酪氨酸蛋白激酶，引起酪氨酸残基的磷酸化，促进神经干细胞的分化和成熟神经元的存活，提升海马神经元在损伤环境下的自我修复及适应能力，调控神经递质的合成和释放，增强突触可塑性，维持AD 病理环境中树突的形态和功能，最终改善认知功能［11-12］。研究表明［13-14］:AD 动物模型及患者BDNF和Trk B受体表达均下降，并与年龄和病程呈负相关，给予痴呆动物模型外源性导入BDNF 则有明显的神经保护作用，减少了Aβ沉积，从而改善了模型的空间学习和记忆能力。本研究中模型组小鼠海马BDNF／Trk B含量下降，从而导致Aβ1-42 含量增加，与文献报道一致［15］。Ori可上调小鼠海马区BDNF／TrkB 的表达，减少Aβ1-42的含量。Aβ沉积形成的老年斑是AD 的经典病理改变，Aβ的生成与清除失衡是AD 的核心发病机制。在体和离体实验均表明BDNF 能通过下调脑Aβ的表达减少老年斑的形成，保护脑内神经元、颗粒细胞、星型胶质细胞等，从而使神经细胞免受Aβ多聚体的细胞毒性损伤，提高神经细胞的存活能力［15］。本研究中APP／PS1转基因痴呆小鼠脑内BDNF 和TrkB受体表达减少，Ori能上调BDNF 和TrkB 受体表达，进而减少海马Aβ沉积，从而提高了空间学习记忆能力。但本研究中Ori影响痴呆动物模型BDNF／Trk B表达无剂量依赖关系，仍需进一步分组研究。