朗格汉斯细胞组织细胞增生症中BRAFV600E、MAP2K1基因突变的分析

孙虹靓，罗建明

（1. 广西医科大学附属第一医院 儿科，广西 南宁 530021；2. 广西地中海贫血防治重点实验室，广西 南宁 530021）

0 引言

朗格汉斯细胞是一种位于表皮中的特异性树突细胞，参与抗原的呈递作用。朗格汉斯细胞组织细胞增生症（LCH）是一种罕见的疾病，形态上表现为朗格汉斯细胞的增殖，其通常与淋巴细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞相关[1]。LCH患者的临床表现和临床过程都具有高度的异质性，轻则表现为皮肤、骨骼的损害，重者可出现多器官的累及，如肝、肾、脾、造血系统等。LCH 的发病机制尚不明确，研究发现其存在着多种基因突变，例如BRAF V600E、ARAF 及MAP2K1 基因等[2]。对于BRAF 和MAP2K1 基因突变对于疾病的预后判断依旧存在着争议，在我国LCH 患者中BRAF和MAP2K1 基因表达的情况如何，未见有详尽的报道，其对疾病预后的判断依旧是一个尚未解决的难题。因此，本研究主要统计并分析在朗格汉斯细胞组织细胞增生症（LCH）中BRAFV600E 和MAP2K1 基因的突变率及其对于患者预后的影响，并进一步分析它的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料。选择于我院就诊的2011 年1 月至2018 年1月确诊为LCH 患者的组织标本50 例，其中男性37 例，女性13 例，患者中位年龄为18.3 岁，平均年龄为27.4 岁，其中单系统累积者41 例（82%），多系统累积者9 例（18%），平均随访时间为37.8 个月。

1.2 PCR 扩增和桑格测序。使用DNA 试剂盒提取50 例患者的病理标本，其中BRAF 基因检测的是外显子（exon）15，主要采用半巢式PCR 的方法进行扩增。MAP2K1 基因检测的是exon2 和exon3，根据文献记载的引物对基因进行PCR 扩增。PCR 产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳，纯化产物，使用测序仪进行测序并利用Chromas 软件来分析测序图。

1.3 统计学分析。运用统计学软件SPSS 24.0 进行分析，用均数±标准差表示计量资料，采用t 检验或秩和检验，用[n（%）]%表示计数资料，行χ2检验或Fisher 精确检验，若P＜0.05，则提示存在差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LCH 中BRAFV600E 和MAP2K1 基因的突变。通过对50 例LCH 患者的标本进行相关基因测序后，结果显示发现13 例BRAFV600E 基因突变，约占26%，5 例患者出现有MAP2K1 基因的突变，突变率为10%，研究发现MAP2K1 和BRAFV600E 基因突变存在有互异性，详见表1。

2.2 基因突变对LCH 的临床意义。对LCH 的临床基本资料进行统计分析，结果显示未成年人共29 例，其中出现BRAF V600E 和MAP2K1 基因突变的分别为10 例、4 例，发生率分别为34.5% 和13.8%。成年人组21 例，其中出现BRAF V600E 和MAP2K1 基因突变的均为2 例，发生率9.5%。BRAF V600E 和MAP2K1 基因突变更多出现在未成年组，BRAF V600E 基因突变在未成年组与成人组间有显著性差异（P=0.026），MAP2K1 基因突变在未成年组与成人组间无显著性差异（P=0.152）。

表1 BRAFV600E 和MAP2K1 基因的突变的分布

3 讨论

朗格汉斯细胞组织细胞增生症（LCH）是一种罕见的克隆性疾病，由于其特有的形态学表现（组织细胞形态上含有大细胞的组织病变），常与淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和巨细胞有关[3]，长期以来一直被归类为单核-巨噬细胞系统的疾病[4]，LCH 病变包括浸润的病理性树突状细胞（8%），巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和富含调节性T 细胞的淋巴细胞。树突细胞表达高水平的T 细胞共刺激因子和促炎细胞因子，细胞因子与趋化因子受体构成“细胞因子风暴”[5]。近来，研究证明大量的树突状细胞可表达多效细胞因子骨桥蛋白，促进T 辅助细胞的产生，组织细胞招募单核细胞和破骨细胞活化，同时也会产生大量组织破坏性酶[6-7]，可导致受累组织的损坏，约75%的患者激活的体细胞中发现BRAF-V600E（57%）和MAP2K1，提示LCH 有肿瘤增殖的过程[8]。BRAF 突变是一种很有前途的诊断和预后指标，也是BRAFV600E 特异性抑制剂靶向治疗的重要指标，探测到BRAFV600E 是判断诊断、预后和治疗的重要指标[9]。

BRAF 蛋白是丝氨酸/苏氨酸激酶RAF 家族的成员，并且是导致转录因子为细胞生长和增BRAF 是RAF 激酶家族的成员，其被RAS 蛋白和RAS 偶联受体酪氨酸激酶激活，RAS 和RAF 的活化复合物将信号传递至丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联的其他部分，包括MEK / ERK 激酶[10]。RAS-RAF-MAPK 途径是通过将信号传递至细胞核，细胞质和细胞膜的受体，从而影响细胞生长、增殖、分化和凋亡，是许多细胞功能的关键调节剂，最常见于黑色素瘤，乳头状甲状腺癌，结直肠癌，也在血液系统疾病中发现。丝裂原活化蛋白激酶1（MAP2K1），也称为 MEK1，编码MEK1 蛋白激酶，是RAF 的已知下游靶标[11]。MAP2K1 的突变与几种人类癌症有关，包括黑色素瘤，肺癌和结肠腺癌等。近几年，靶向基因组测序揭示了LCH 中高频率的MAP2K1 突变，提示与LCH 发病有相关性[12]。此外，据报道MAP2K1 突变与LCH 中的BRAF 突变相互排斥，这与本研究的结果相似。本研究发现，朗格汉斯细胞组织细胞增生症中BRAFV600E 和MAP2K1 可发生基因突变，常见于未成年组，对于患者的生存时间无明显影响。