血清外泌体miRNA-30a-5p在人脑胶质瘤诊断及预后评价中的作用

杨 智 唐 栋 曹 磊 杨光诚

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占原发性脑肿瘤的70%以上。尽管过去几十年里，胶质瘤的治疗取得了长足进步，但是总体生存率未见明显提高[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤的发生和发展中起着重要作用，对肿瘤的早期诊断也有重要意义[2]。既往研究证实，外泌体miRNA非常稳定，因此适合作为潜在的生物学标志物[3]。外泌体miRNA可作为肿瘤早期诊断、治疗及预后的生物学标志物。本文探讨胶质瘤病人血清外泌体miRNA-30a-5p的表达水平，及其在诊断及预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2014年1月至2015年12月收治的胶质瘤60 例为研究对象，其中男32 例，女28 例；年龄10～78 岁，平均（47.36±8.01）岁。纳入标准：术前未接受手术或放化疗；术后病理组织学检查证实为胶质瘤；病例资料完整。排除标准：合并其他类型肿瘤；复发性胶质瘤；合并急慢性感染性疾病。另选取健康体检者40 例为对照，其中男22 例，女18 例；年龄18～56 岁，平均（44.39±11.11）岁。本研究已经过本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 外泌体的分离 胶质瘤病人术前抽取空腹肘静脉血5 ml，取血清800 μl，4 ℃条件下2 000转/min离心20 min，取上清液。加入1/3体积的外泌体分离试剂（北京天恩泽基因科技有限公司），混匀。4 ℃下静置20 min，15 000转/min离心2 min。弃去上清液，以50 μl 的PBS 重悬沉淀，分装后在-70 ℃冰箱中保存备用。

1.3 外泌体电镜观察 将冻存的外泌体重悬液于室温下放置10～15 min使其溶解。取10 μl外泌体滴加于铜网上沉淀60 s，用滤纸吸取悬液。取醋酸双氧铀（北京中镜科仪技术有限公司）10 μl 滴加于铜网上沉淀60 s，吸干液体。在常温下干燥10 min，用Tecnai Spirit G2透射电子显微镜观察外泌体形态。

1.4 免疫印迹法法检测外泌体标志物CD63 的表达将冻存的外泌体重悬液室温下放置10～15 min 使其溶解。用Nanosight 系统（英国Malvern 公司）检测外泌体的浓度。检测浓度为1.0 μg/μl 和0.5 μg/μl 时外泌体CD63 的表达情况。取100 μl，向其中加入RIPA细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司），提取蛋白。用BCA试剂盒（美国Sigma公司）进行蛋白定量检测，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳，将分离的蛋白电转至PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶封闭，加入兔抗人CD63 单克隆抗体（1∶1000，美国Sigma 公司），4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入羊抗兔二抗（1∶5 000，美国Sigma公司），温室下作用1 h，再用TBST洗涤3次。最后用ECL显影。内参为GAPDH。

1.5 RT-PCR 检测外泌体miRNA-30a-5p 表达水平将冻存的外泌体重悬液室温下放置10～15min 使其溶解。取100 μl，用miRNAOUT试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司）提取样本miRNA，随后进行miRNA逆转录。miRNA-30a-5p引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司设计并提供，上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游引物5′-TGTAAACATCCTCGACTGGAAG-3′。用RT-PCR 试剂盒（美国Sima公司）检测miRNA相对表达量。以U6作为内参（上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下 游 引 物5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′）。用2-△CT计算miRNA-30a-5p的表达量。

1.6 随访 采用门诊及电话方式进行随访。术后半年内，每3个月随访1次；此后，每半年随访1次。总生存期（overall survival，OS）定义为术后第一天至死亡或最后一次随访。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0进行分析；正态分布计量资料用±s 表示，用t 检验；计数资料采用χ2检验；等级资料用秩和检验；受试者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析诊断价值，计算曲线下面积（area under curve，AUC）、灵敏度和特异度；用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，采用logrank检验；多因素Cox比例回归风险模型分析危险因素；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体标志物CD63的表达情况 电镜下外泌体呈圆形囊泡状，单个分布或聚集分布，囊泡外周可见膜性结构，直径在60～150 nm（图1）。1.0 μg/μl 外泌体的CD63相对表达量明显高于0.5 μg/μl外泌体（图2）。

2.2 胶质瘤血清外泌体miRNA-30a-5p 的表达水平胶质瘤病人血清外泌体miRNA-30a-5p相对表达量明显高于正常人（P＜0.001，图3）。

2.3 血清外泌体miRNA-30a-5p 诊断胶质瘤的价值ROC 曲线分析显示，血清外泌体miRNA-30a-5p 诊断胶质瘤的AUC 为0.901（95%置信区间0.812～0.986），最佳截断值为0.601。miRNA-30a-5p 表达量为0.601时，诊断胶质瘤的灵敏度和特异度分别为78.05%和93.55%（图4）。

表1 胶质瘤病人预后影响因素的Cox比例回归风险模型分析结果

2.4 血清外泌体miRNA-30a-5p 与胶质瘤病人预后的关系 术后60 例均得到有效随访，随访时间平均（28.39±3.25）个月。Kaplan-Meier 分析结果显示，血清外泌体miRNA-30a-5p低表达病人总体生存时间高于高表达病人（P＜0.001，图5）。多因素Cox 比例回归风险模型分析结果显示，WHO 分级高、KPS 评分低、miRNA-30a-5p 高表达是胶质瘤病人不良预后的独立影响因素（P＜0.05，表1）。

3 讨论

外泌体miRNA 是近年来研究的热点。外泌体miRNA 具有肿瘤特异性，在不同贮存条件下都较为稳定[3]。miRNA 在胶质瘤的筛查、诊断及预后评估中具有重要作用[5]。本文结果发现，胶质瘤病人血清外泌体miRNA-30a-5p 表达水平明显升高，可作为胶质瘤早期诊断及判断预后的指标。

miRNA-30a-5p 在胶质瘤中的作用机制尚不明确。Wang等[6]发现，miRNA-30a-5p可以靶向调控神经细胞粘附分子通过Wnt/β-catenin 通路促进胶质瘤细胞增殖和侵袭。本文胶质瘤病人血清外泌体miRNA-30a-5p 相对表达量为明显高于正常人。血清外泌体miRNA 对胶质细胞瘤的早期诊断有重要价值[7]。有学者发现，血清外泌体miRNA-310a有助于早期诊断胶质瘤，灵敏度和特异度分别为82.6%和93.2%。

本文同样发现，血清外泌体miRNA-30a-5p 诊断胶质瘤的价值较高，灵敏度和特异度分别为78.05%和93.55%。Lan 等[8]发现胶质瘤血清外泌体miRNA-310a 的表达水平明显高于垂体腺瘤、脑膜瘤、中枢神经系统B 细胞淋巴瘤。这提示血清外泌体miRAN有助于颅内肿瘤鉴别诊断。本文还发现，miRNA-30a-5p 高表达胶质瘤病人较低表达病人生存期明显缩短。多因素Cox比例回归风险模型分析结果显示血清外泌体miRNA-30a-5p高表达是胶质瘤病人预后不良的独立危险因素。这提示血清外泌体miRNA-30a-5p可作为胶质瘤预后评估指标。