海珠益肝加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用

张云城 盛国光 胡世平

摘要 目的：探討海珠益肝加味方对刀豆蛋白A（Concanavalin A）诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用。方法：健康昆明雄性小鼠100只，随机分为10组，包括正常组、模型组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组，每组10只，造模两周前，正常组及模型组给予温开水灌胃，其余组分别给予海珠益肝全方，海珠益肝方加太子参、枸杞子，海珠益肝方加太子参、淫羊藿，海珠益肝方加枸杞子、淫羊藿、叶下珠、白花蛇舌草、海藻、茯苓、白芥子、莪术及泼的松灌胃，静待60 min后，正常组给予尾静脉注射8 mL/kg生理盐水，其他组给予尾静脉注射16 mg/kg Concanavalin A建模，期间暂停饮水并静待12 h后摘眼球取血、颈椎脱臼处死动物取肝脏脾脏，计算肝脾指数。并检测ALT、AST、SOD及MDA指标。结果：正常组、A组、B组、C组、D组、G组、H组的小鼠肝脾指数明显低于模型组，其他组无明显作用，正常组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组的ALT、AST、SOD明显高于模型组（P<0.05），正常组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组的MDA明显低于模型组（P<0.05）。结论：海珠益肝方加味方能有效降低免疫性肝损伤转氨酶水平，减轻肝细胞膜脂质过氧化反应，从而达到保护肝脏的目的。

关键词 海珠益肝加味方;刀豆蛋白A;免疫性肝损伤;肝脾指数;丙氨酸氨基转移酶;天门冬氨酸氨基转移酶;超氧化物歧化酶;丙二醛

Abstract Objective：To investigate the protective effects of Modified Haizhu Yigan Formula on mice with Concanavalin A（Concanavalin A）-induced immune liver injury.Methods：A total of 100 Kunming mice were randomly divided into normal group，model group，group A，group B，group C，group D，group E，group F，group G and group H，with 10 cases in each group.2 weeks before modeling，the normal group and model group were given warm boiled water by gastric lavage.The other groups were given Haizhu Yigan Formula，Haizhu Yigan Formula plus Radix Pseudostellariae and Fructus Lyci，Haizhu Yigan Formula plus Radix Pseudostellariae Xianlingpi，Haizhu Yigan Formula plus Fructus Lycii Xianlingpi，YexiaZhu Baihua Sheshecao，Haizao Poria，Bai Jiezi，Rhizoma Curcumae and Podisong for gastric perfusion.After 60 minutes，the normal group was injected with 8 mL/kg normal saline by caudal vein，the other groups were injected with 16 mg/kg Concanavalin A by caudal vein.During this period water was suspended.After waiting for 12 h，remove eyeballs and take blood.The animals were sacrificed by cervical dislocation and the liver and spleen were taken to calculate the liver-spleen index.The indexes of ALT，AST，SOD and MDA were detected.Results：The liver and spleen indexes of normal group，group A，group B，group C，group D，group G and group H were significantly lower than those of model group，but the other groups had no obvious effects.ALT，AST and SOD in normal group，group A，group B，group C，group D，group E，group F，group G and group H were significantly higher than those in model group.The MDA levels in normal group，group A，group B，group C，group D，group E，group F，G group G and group H were significantly lower than those in model group（P<0.05）.Conclusion：Modified Haizhu Yigan formula can effectively reduce the level of ammonia transfusion in immunological liver injury，reduce the lipid peroxidation of liver cell membrane，so as to achieve the purpose of protecting liver.

Keywords Modified Haizhu Yigan Jiawei Formula; Concanavalin A; Immunological liver injury; Liver and spleen index;ALT; AST;SOD;MDA

海珠益肝加味方是湖北省中医院肝病科盛国光教授根据中医理论，创造临床上治疗慢性乙型肝炎的协定方，主要组成有叶下珠、海藻、白花蛇舌草、白芥子、茯苓、莪术等，有清热解毒、健脾化痰、活血祛瘀之功效。其降转氨酶的作用最为显著，但该药物的应用机制还需进一步研究[1-2]。我国是病毒性肝炎高发区，其中慢性乙型病毒性肝炎（CHB）占大多数，临床上用海珠益肝加味方治疗CHB十分有效[3]。用刀豆蛋白A（Concanavalin A）诱导的小鼠急性肝损伤模型具有操作简单、肝脏特异性等特点广泛应用于各种肝病的研究中[4-5]。对此，本研究为确保海珠益肝加味方治疗慢乙肝有效的机制，我们通过建立建模实验探讨海珠益肝加味方对Concanavalin A诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

昆明小鼠，由湖北省实验动物研究中心提供，許可证号：SCXK（鄂）2008-0008，共100只，5周龄，雄性，体质量18～22 g。小鼠由提供方喂养。

1.1.2 药物

海珠益肝全方，海珠益肝方加太子参、枸杞子，海珠益肝方加太子参、淫羊藿，海珠益肝方加枸杞子、淫羊藿、叶下珠、白花蛇舌草、海藻、茯苓、白芥子、莪术均由湖北省中医院制剂室提供，泼尼松片（上海上药信谊药厂有限公司，国药准字H31020771），所有药物剂量依据说明应用。

1.1.3 试剂与仪器

Concanavalin A（C2010，批号：80M7680V）购自Sigma公司。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考马斯亮兰试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号依次为20120410、20120407、20120412、20120413、20120406）。美谱达UV6100S可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

所有小鼠均给予正常饲养1周后，将100只小鼠随机分为正常组、模型组、A—H组，每组10只，即A组（泼尼松）、B组（海珠益肝方全方）、C组（海珠益肝方加太子参、枸杞子）、D组（海珠益肝方加太子参、淫羊藿）、E组（海珠益肝方加淫羊藿、枸杞子）、F组（叶下珠、白花蛇舌草）、G组（海藻、茯苓、白芥子）、H组（莪术）。根据文献[6]，在疗程结束后60 min，给予正常组所有小鼠尾静脉静注氯化钠溶液10 mL/kg，其他各组给予小鼠尾静脉静注20 mg/kg Concanavalin A+0.9%的氯化钠溶液稀释，浓度为2 mg/mL。

1.2.2 给药方法

正常组和模型组给予温开水干预，其余组给予药物干预，即A组（7.8 mg/kg泼尼松）、B组（9.5 mL/kg海珠益肝方全方）、C组（13.4 mL/kg海珠益肝方加太子参、枸杞子）、D组（13.4 mL/kg海珠益肝方加太子参、淫羊藿）、E组（13.4 mL/kg海珠益肝方加淫羊藿、枸杞子）、F组（3.9 mL/kg叶下珠、白花蛇舌草）、G组（4.8 mL/kg海藻、茯苓、白芥子）、H组（0.78 mL/kg莪术），1 d/次，疗程为2周。

1.2.3 检测指标与方法

肝组织指标检测，取10组小鼠的肝组织在4 ℃氯化钠溶液中漂洗，除去相关杂质后风干，称取肝组织0.20 g，制成10%匀浆与无菌试管中，分离匀浆（3 000 r/min，10 min）后，通过考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测总蛋白浓度。酶联免疫吸附法检测SOD水平，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定MDA含量[7-9]。肝酶检测是取小鼠血清0.2 mL，采用赖氏法测定ALT和AST水平。肝组织病理检查是再称取肝组织0.20 g，经10%甲醛固定和石蜡包埋后、连续切片进行脱蜡，切片厚度均为4 μm，根据SP法染色后于400倍视野下观察其组织结构。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理，计数资料以（%）表示采用χ2检验，计量资料以（±s）表示采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有小鼠干预前后生命体征均良好，且干预后无小鼠死亡。

2.1 各组小鼠肝脾指数变化 正常组、A组、B组、C组、D组、G组、H组的小鼠肝脾指明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。E组、F组对肝脾指数影响比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠肝组织中ALT、AST的变化 正常组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组的ALT、AST明显高于模型组，其中C组降ALT、AST水平效果更优，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

2.3 各组小鼠肝组织MDA、SOD变化 正常组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组的SOD明显高于模型组，正常组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组的MDA明显低于模型组（P<0.01或P<0.05）。见表3。

2.4 各组肝组织HE染色变化 光镜检查：正常组：小鼠肝脏无异常，在HE染色中肝细胞大小正常，排列整齐。模型组：HE染色的肝细胞浆颜色变浅，细胞分散，肝窦不清晰，且不见肝索，甚至有可见点状坏死、炎细胞浸润等表现。其他各组均能降低肝脏炎症坏死，尤其是D组最为明显，如图1～10。

3 讨论

肝脏的生理功能最为复杂，肝脏损伤的疾病发病机制相应地也变得十分复杂。Concanavalin A是一种糖类结合蛋白质，具有促有丝分裂作用，能够促淋巴细胞转化反应的作用[10-11]，武建毅[12]等报道静脉注射BALB/c小鼠8～12 h内可引起明显的肝损害，且提示其机制可能是T细胞亚群介导，此与机体的急性肝炎发病机制相似，故Concanavalin A诱导的肝损伤老鼠模型可作为模拟人体肝损伤模型。而本研究结果显示，给予模型老鼠药物干预可降低Concanavalin A诱导的小鼠升高的血清转氨酶活力，且能降低ConA诱导的急性免疫性肝损伤炎性反应递质TNF-α水平，从而使肝细胞逐渐恢复正常形态，进一步提示在海珠益肝加味方的干预可有效预防肝损伤。由此可见，改善患者的免疫系统及降低炎性物质的分泌可提高肝脏功能的运行[13-15]。免疫性肝损伤的主要病机为湿毒、痰滞、血瘀，继而痰凝，久而入血致瘀。因此，解毒化痰活血祛瘀亦为慢性肝炎治本之法。海珠益肝加味方是治疗慢性肝炎的经验方，由叶下珠、海藻、白花蛇舌草、白芥子、茯苓、莪术组成，全方具有清热解毒、健脾化痰、活血祛瘀之功，可有效去湿毒、痰滞、血瘀，继而改善急性肝炎[16-17]。

临床上我们观察到较多慢乙肝患者病情缠绵，最后有一个急性加重发作的过程。对此，本研究通过给予小鼠海珠益肝扩方及拆方药物干预，结果发现加用扶正中药后降酶效果更佳，能够有效提高机体免疫和降低炎性反应。另外我们还发现活血化瘀组单用就可以降低肝脾指数，且海珠益肝加味方能够提高SOD水平同时降低MDA水平，继而加强患者的抗氧化能力，提高机体的自由基清除，从而起到保护肝脏的作用[8]。

综上所述，海珠益肝方加味能有效降低免疫性肝损伤转氨水平，减轻肝细胞膜脂质过氧化反应，达到保护肝脏的目的。但海珠益肝加味方抗肝损伤的作用多方面的，其机制尚不清楚，故其对肝脏的免疫功能和炎性反应的干预机制有待进一步研究。

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（2018-05-08收稿 责任编辑：苍宁）