基于DNA条形码技术的中药材木通种子鉴定研究

穆威杉 于娟 赵晴

摘要 目的：利用核糖体内部转录间隔区2（ITS2）及叶绿体psbA-trnH序列对中药材木通种子进行鉴定，建立其种子DNA条形码鉴定方法，保障中药材木通种子的准确性。方法：收集木通种子样品15份，通过提取DNA、聚合酶链式反应（PCR）扩增、双向测序，获取其ITS2及psbA-trnH序列。基于BLAST分析、邻接（NJ）系统发育树构建进行物种鉴定分析。结果：共获得4种类型ITS2序列，2种类型psbA-trnH序列。ITS2及psbA-trnH均可区分木通与川木通、关木通，但ITS2序列可以区分木通与三叶木通、白木通，psbA-trnH序列无法区分木通与三叶木通、白木通。结论：DNA条形码技术可用于木通种子及其易混伪品的鉴定。

关键词 木通;种子;DNA条形码;ITS2;psbA-trnH;鉴定;混伪品;序列分析

Abstract Objective：By internal transcribed spacer 2（ITS2）and plastid intergenic region psbA-trnH sequences，the Akebiae Caulis seeds would be identified and DNA barcoding technology has been established，to guarantee the species authenticity of Akebiae Caulis seeds，a Chinese medicinal material.Methods：A total of 15 samples of Akebiae Caulis seeds were collected from different areas.Their ITS2 and psbA-trnH sequences have been obtained after DNA extraction，polymerase chain reaction（PCR）and bi-directional sequencing.Species identification analysis was based on BLAST analysis and neighbor joining（NJ）phylogenetic tree method.Results：A total of 4 types of ITS2 sequences and 2 types of psbA-trnH sequences were obtained.ITS2 and psbA-trnH sequences can distinguish Akebiae Caulis and Clematidis Armandii Caulis，and Caulis Aristolochiae Manshuriensis.But the ITS2 sequence can distinguish Akebia quinata and Akebia trifoliata，Akebia trifoliata var.austrais.The psbA-trnH sequence cannot distinguish Akebia quinata and Akebia trifoliata，Akebia trifoliate var.austrais.Conclusion：DNA barcoding can be useful for origin identification of Akebiae Caulis seeds and its adulterants.

Keywords Akebiae Caulis;Seeds;DNA barcoding;ITS2;psbA-trnH;Identification;Adulterants; Sequence analysis

木通为木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三叶木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.austrais（Diels）Rehd.的干燥藤茎，具有通经下乳、利尿通淋、清心除烦的功效，是龙胆泻肝丸等10余种中成药的处方成分[1]。木通科植物的主要有效化学成分为三萜皂苷，另外还含有木脂素类、黄酮类、有机酸等成分[2-3]，具有很高的药用价值。现代药理学表明，木通可以利尿抗菌[4]、抗肿瘤[5]，具有显著的抗氧化活性[6-7]，木通籽油提取物具有抗肿瘤细胞增殖的药理作用[8]。

由于本草文献存在药材的名字与实际不符、不同地区用药习惯不同以及同名异物的现象，导致市售木通基原混乱，尤其易将木通与川木通、关木通混淆[9]。根据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）记载，川木通来源于毛茛科铁线莲属植物小木通Clematis armandii Franch.或绣球藤Clematis montana Buch.-Ham.的干燥藤莖[1]。关木通为马兜铃科植物东北马兜铃Aristolochia manshuriensis Kom.的干燥藤茎[10]。根据黄得栋等[11]对木通及川木通药材的使用和市场情况进行调查，发现由于川木通进货容易、收益较高，部分商家难以区分川木通与木通，市场上存在川木通代替木通的现象。关木通曾在1963版至2000版《中国药典》中被收载，但由于其含有马兜铃酸类成分，可导致肾毒性[12]，关木通已于2003年被国家药品监督管理局禁用[13]。另外有研究证明，马兜铃酸Ⅰ更容易被微粒体细胞色素P450氧化，明确了其较高的致癌性[14]。木通、川木通、关木通3种“木通类”药材虽名字相近，但化学成分及疗效均存在差异，若将处方中的正品木通误以混伪品代替，不仅药效难以保障，还会给临床用药带来严重的安全隐患。在国家取消关木通的药用标准之后，木通的正品地位得到加强，市场对木通的需求量逐渐增加，木通的人工繁殖和栽培逐渐引起人们重视。木通可以通过种子、埋条、分根、扦插[15]等方式繁殖，从源头上确保木通种子物种正确至关重要。

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术[16]。这种鉴定方法不依赖于专业人员的主观经验以及植物的形态特征，不受时间、气候等外界因素的影响[17]，针对物种的遗传信息进行鉴定，具有客观、准确等优点，是对中药传统鉴定法的有效补充[16]。目前，DNA条形码鉴定技术日渐成熟，已经逐步应用于种子种苗的鉴定中。高婷等[18]应用DNA条形码技术对种子类中药冬葵子和苘麻子及其混伪品进行鉴定，证明ITS2序列可以准确鉴定冬葵子和苘麻子。林凤越等[19]应用DNA条形码技术对人参及同属易混品西洋参种子进行研究，证实了ITS2序列可以用于人参种子真伪鉴定。本课题组已利用DNA条形码技术对中药材桔梗种子[20]、黄芩种子[21]、金莲花种子[22]、北苍术种苗[23]的ITS2序列及知母种子[24]的psbA-trnH序列进行鉴定研究，表明DNA条形码技术可准确有效地鉴定这些中药材种子种苗的真伪。种子种苗作为中药材种植的源头，其鉴定标准及生产经营管理机制仍不够完善[25-26]，将DNA条形码技术应用于种子种苗的鉴定，从源头对药材的基原进行把关，对推进中药材种子种苗的标准化有重要意义。

本实验以木通种子为研究对象，尝试建立基于ITS2序列和psbA-trnH序列的木通种子DNA条形码鉴定新方法，为准确鉴定木通种子真伪提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 球磨仪（Retsch公司，德国，型号：MM400型）;涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：VORTEX-5型）;三温三控水槽（海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：DK-8D型）;离心机（Sigma公司，德国，型号：1-14型）;聚合酶链反应（PCR）仪（Bio-Rad公司，美国，型号：T100型）;超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，美国，型号：Nanodrop One型）;电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-6C型）;凝胶成像仪（Bio-Rad公司，美国，型号：Gel DocTMXR+型）;电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，德国，型号：SQP型）。

1.2 试剂 植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，批号：R6718];2×Taq PCR Master Mix试剂（北京艾德莱生物科技有限公司，批号：301926AX）;GelRed核酸染料（Biotium公司，批号：41003）;AL2000 DNA Maker（北京艾德莱生物科技有限公司，批号：292253AX）;琼脂糖（BIOWEST公司，西班牙，批号：111860）;引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.3 分析样品 收集木通种子样品15份，经承德医学院中药研究所刘金欣副教授鉴定，均為木通属植物种子，但无法准确鉴定到物种，所有样品存放于承德医学院，样品信息见表1。木通和川木通参考序列来自《中国药典中药材DNA条形码标准序列》[17]，关木通参考序列来自于Wu等[27]的研究论文。

2 方法与结果

2.1 DNA提取、PCR扩增及测序 取木通单粒种子，采用天根植物DNA提取试剂盒提取DNA。使用Nanodrop ONE型超微量分光光度计检测木通种子DNA浓度和质量。依据《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》[5]对木通种子DNA的ITS2和psbA-trnH片段进行PCR扩增，对PCR产物进行双向测序。

2.2 数据分析 测序峰图利用CodonCode Aligner v.8.0.2软件进行校对拼接，切除5.8S rRNA和28S rRNA区域获得ITS2序列，5.8S motif的序列为“CGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCA”，28S motif的序列为“CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC”;切除psbA和trnH区域以获得psbA-trnH序列，psbA motif的序列为“TCGAGCTCCAGCGACAAATGGATAA”，trnH motif的序列为“GGCGGATGTACCCAAGTGGCTCAGG”。在中药材DNA条形码鉴定系统（http：//www.tcmbarcode.cn）对所获得的序列进行BLAST比对，利用MEGA-X-10.0.5软件构建NJ系统发育树。

2.3 结果

2.3.1 DNA提取、PCR扩增、测序测定及序列注释DNA提取结果显示，木通种子样品DNA浓度平均值为112.6 ng/μL，A260 nm/A280 nm值多数位于1.8～2.0之间，表明提取的DNA质量较高，可进行后续实验。电泳凝胶成像检测表明：ITS2和psbA-trnH序列分别在500 bp和600 bp左右呈现单一且明亮条带。测序结果表明：ITS2序列可以获得高质量双向测序峰图，部分样品存在较少数量的SNP套蜂;psbA-trnH序列由于存在两处长度在10 bp以上的polyT结构，影响polyT结构之间部分的测序质量，但经双向序列拼接和序列矫正后可以满足后续分析需要。基于同科序列构建ITS2和psbA-trnH序列注释用motif，注释后ITS2和psbA-trnH序列长度分别为216 bp和476～471 bp（含不确定长度polyT）。

2.3.2 基于ITS2序列的木通种子鉴定 共获得4种类型（I1、I2、I3、I4）的ITS2序列，比对后序列长度为216 bp。经BLAST序列比对和系统发育树分析，I1、I2、I3可以鉴定为三叶木通或白木通，I4可以鉴定为木通;木通可以与三叶木通、白木通相互区分，第190位的G碱基是木通的专属性SNP鉴定位点;白木通作为三叶木通的亚种，无法与三叶木通清晰区分，部分样品在第42位、50位、103位、173位存在不同程度的测序套蜂;共有8个样品存在个体间的ITS2序列差异，表明样品内种子存在不同程度的异质性;由NJ系统发育树可以看出，4种类型的ITS2序列与木通药材不同基原参考序列聚为独立的一大支，可以与川木通、关木通清晰区分，见图1，具备与混伪品的区分鉴定能力。

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（2020-02-10收稿 责任编辑：芮莉莉）