贵州大果木姜子对急性心肌缺血损伤的保护作用

李亚辉，杨欣

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

近年来心血管疾病的发病率、病死率在全球范围内呈逐年上升趋势。大果木姜子又名米槁,是樟科(Lauraceae)樟属植物米槁(CinnamomummigaoH.W.Li.)的干燥果实，为苗族、布依族的民间常用药材，主要分布于中国的贵州、广西和云南等地[1-3]。不仅可以药用，也可以食用，其果实、根茎和叶都有药用价值。在多种疾病中有较好的治疗效果，尤其是对冠心病、心绞痛的患者有明显的缓解疼痛作用[4-5]。已经有研究表明：大果木姜子挥发油在急性心肌缺血、实验性心律失常、抗缺氧等方面发挥重要作用，尤其在抗菌(细菌、真菌)、抗病毒方面具有良好的效果[6]。还可应用于生产、食品的防腐等方面，以米槁挥发油为主要原料开发的米槁精油滴丸、理气活血滴丸，被广泛应用到冠心病、心绞痛、胸痛、心悸等疾病的治疗中[7-9]。但是有关大果木姜子水煎液体外抗氧及其对心肌缺血的作用尚未研究，因此本研究采用皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素建立大鼠心肌缺血模型，测定大果木姜子水煎液对大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的影响，同时明确体内总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)的含量变化，并进一步分析心肌组织的病理变化情况。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

健康SD雄性大鼠48只，体质量250～290 g。由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号SCXK(湘)20140010。

1.2 实验药材

所选用的贵州大果木姜子由贵州益佰制药股份有限公司提供，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为樟科(Lauraceae)樟属植物米槁(GinnamomummigaoH.W.Li.)的干燥成熟果实，标本存于贵州中医药大学药理实验室(20180003)；盐酸异丙肾上腺素(ISO，上海禾丰制药有限公司)；普萘洛尔(江苏亚邦爱普森药业有限公司)；乌拉坦(上海山浦化工有限公司)。

1.3 实验试剂及仪器

还原型谷胱甘肽(GSH，南京建成生物工程研究所)；天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)(长春汇力生物技术有限公司)；总抗氧化能力检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；Moticam3000显微摄影成像系统(美国)；徕卡2135型切片机(德国)；Midray BA-88A半自动生化分析仪(中国)；Thermo Scientific Evolution 260 Bio紫外分光光度仪(美国)；双蒸水为本实验室用MilliQ纯水仪制备。

2 方法

2.1 大果木姜子水煎液的制备

称取一定量药材置入圆底烧瓶中，加入10倍量蒸馏水浸泡30 min，武火(大火)加热至沸腾，然后文火(小火)保持微沸状态60 min，趁热将药渣过滤；剩余药渣中加入 8倍量蒸馏水，武火加热至沸腾，然后文火保持微沸60 min，趁热将药渣过滤。将2次滤液进行合并，浓缩后制成1 g/mL(生药量)中药水提液，4 ℃储存备用。

2.2 急性心肌缺血模型制备及给药

复制心肌缺血模型[10-11]，健康雄性SD大鼠48只，雄性，体质量250～290 g。由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物适应环境后随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性药组(普萘洛尔)和大果木姜子高、中、低剂量组，每组各8只。大鼠适应7 d后开始实验，给药组剂量均为2015年版《中华人民共和国药典》人用高限剂量等效剂量的3.5倍，7倍，14倍，大果木姜子组高、中、低给药剂量分别为600 mg/kg，300 mg/kg,150 mg/kg，阳性药(普萘洛尔)给药剂量为20 mg/kg[12]，模型组和正常组给予相应体积双蒸水，各组给药第7天，除空白组外，其余各组在给药后1 h分别皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素30 mg/(kg·d)，每日1次，连续3 d。空白组注射等剂量的生理盐水。各组饲养过程中保持室内环境条件均衡，自由进食饮水。

2.3 实验取材

实验取材前大鼠禁食12 h，不禁水，次日上午大鼠通过腹腔内注射1%戊巴比妥钠(0.15 mL/100 g)麻醉，迅速打开腹腔，腹主动脉取血，用于生化指标检测。取出心脏切成0.5～1 cm3大小，用10%中性福尔马林固定，使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，常规石蜡制片，HE染色，光镜观察。

2.4 对大鼠血液生化指标的影响

SD大鼠腹主动脉取血后静置，3 500 r/min离心15 min，取1 mL上清液置2 mL离心管中。采用Midray BA-88A半自动生化分析仪检测血液生化指标，具体指标包括：天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)。

2.5 血清总抗氧化能力(T-AOC)

取适量100 mmol/L FeSO4-7H2O溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L绘制标准曲线，血液样本采集后需及时分离血清，每个样本取5 μL，按照试剂盒标准操作方法进行检测，37 ℃孵育3～5 min，采用酶标仪在波长593 nm测定样品浓度。用作图软件制得曲线公式，把样本测定管测得的OD代入计算公式，求得结果。在酸性条件下抗氧化物质可以还原Fe3+-TPTZ产生蓝色的Fe2+-TPTZ，在593 nm处读取吸光度可以计算出样品中的总抗氧化能力。

2.6 检测血清中还原型谷胱甘肽(GSH)的含量

谷胱甘肽(GSH)使用南京建成96T试剂盒，依据说明书进行操作，取适量1 mmol/L GSH标准品稀释至100、50、20、10、5、0 μmol/L绘制标准曲线，取样本血清50 μL按照标准操作方法进行检测，采用酶标仪在405 nm的吸光度测定样品浓度，单位为μmol/L。

2.7 病理组织学观察

取完整心脏组织，将其放入4%多聚甲醛中固定24 h后进行石蜡包埋。沿心尖连续做冠状切片，切成0. 5～1 cm3大小，苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色，用中性树胶进行封片，排除气泡，光镜观察并拍照。

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 各组大鼠血清中CK、LDH和AST的含量比较

大鼠注射ISO后，与空白对照组相比，模型组血清中CK极显著升高(P<0.01)。与模型组相比，大果木姜子高、中、低剂量血清中CK明显降低(P<0.05)，尤其中剂量、低剂量具有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组相比，各实验组血清中AST没有发生较大变化；与空白对照组相比，模型组LDH含量增高，有统计学意义(P<0.01)，与模型组相比，大果木姜子高剂量显著降低(P<0.05)，中剂量、低剂量具有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。

表1 各组大鼠血清中CK、AST、LDH的含量变化比较

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各组大鼠血清还原型谷胱甘肽(GSH)和总抗氧化能力(T-AOC)的比较

大果木姜子对大鼠血清中还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)和总抗氧化能力 (T-AOC)的影响结果见图1。与空白对照组比较，模型组GSH含量降低，具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，大果木姜子、中剂量、低剂量能提高GSH含量，高剂量、中剂量具有统计学意义(P<0.05)，低剂量具有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组比较，模型组T-AOC含量降低，具有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，大果木姜子中剂量、低剂量能提高T-AOC的含量，中剂量具极显著有统计学意义(P<0.05)，低剂量具有极显著统计学意义(P<0.01)。结果见表2。

表2 各组大鼠血清中GSH和T-AOC的含量比较

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 组织病理学检查

心脏病理结果显示：空白对照组大部分心肌细胞排列比较整齐、成束排列，紧密没有发生病理改变(图2A)。急性心肌缺血模型大鼠有明显缺血性损伤，可见炎性细胞浸润，小灶性肌纤维坏死，心肌坏死面积较大，证实皮下注射异丙肾上腺素能致心肌急性缺血性损伤(图2B)。阳性药组和大果木姜子高、中、低剂量组均可改善ISO引起的大鼠心脏组织细胞形态变化，以大果木姜子中剂量、低剂量对心脏病理损害改善较为明显(图2C～F)。结果见图2。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 GSH和T-AOC在各大鼠血清中的含量比较

注：A：空白组；B：模型组(30 mg/kg)；C：阳性药组(20 mg/kg)；D：大果木姜子低剂量(150 mg/kg)；E：大果木姜子中剂量(300 mg /kg)；F：大果木姜子高剂量(600 mg/kg)。图2 大鼠心脏HE染色图(×200)

4 讨论

目前，心脑血管疾病已经成为危害人类健康的重大疾病。而缺血性心脏病占有较大的比例，由冠状动脉发生病变而导致其心肌缺血和坏死，其心肌弥漫性纤维化与硬化，出现心脏腔室变大及心力衰竭[13-14]。中药具有多成分、多靶点、多调节等特点，让其在多种疾病中发挥重要作用，受到研究者的重视。心血管疾病与氧化应激关联密切，很多研究表明通过抗氧化系统、调节 Ca2+平衡、保护内皮细胞、促血管新生等发挥保护心肌的作用，心血管疾病在治疗过程中迫切需要开发多靶点、毒性低的天然药物。

已有研究表明,大果木姜子挥发油在急性心肌缺血、实验性心律失常、抗缺氧等方面发挥重要作用，尤其在抗菌(细菌、真菌)、抗病毒具有良好的效果。孙学惠等[4]通过实验致急性实验性心肌缺血，观察大果木姜子挥发油(CV-3)的抗心肌缺血作用，结果表明大果木姜子中挥发油成分可降低心肌梗塞的范围以及梗塞后血清中乳酸脱氢酶(LDH)的水平，因此对急性心肌缺血而言CV-3有较好的保护作用。钱斌等[8]对大鼠冠状动脉结扎致急性心肌缺血状态，并给予小鼠大果木姜子口服乳剂(CV-KF)和静脉乳剂(CV-JM)，研究发现给药后能减少梗死后肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)水平，表明CV-KF和CV-JM对急性心机缺血有良好的保护作用。但是对大果木姜子水煎液在心血管方面的研究较少，仍然需要进一步对其进行研究和开发。

异丙肾上腺素是经典的β1和β2受体激动剂，主要是氧自由基的生成和细胞内钙离子浓度升高而致心肌损伤。连续给大鼠腹腔内注射ISO会致与人相似性的急性心肌缺血损伤模型[15]。心肌缺血时常常伴有心脏功能及血流动力学的变化，在心肌缺血时，由于缺氧所导致的代谢障碍使ATP减少，钾离子从细胞内流失，心肌的兴奋-收缩偶联障碍以及心肌收缩力减弱。大鼠血液内CK、AST、LDH的升高作为参考指标用来诊断细胞坏死性疾病。

机体中存在的抗氧化的大分子、小分子及酶可以清除体内产生的各种活性氧，阻止活性氧诱导产生氧化应激[16]。本研究中大果木姜子高剂量、中剂量、低剂量能提高谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，高剂量、中剂量具有显著差异(P<0.05)，GSH分布广泛，参与细胞的多种功能活动，具有抗氧化、解毒、保护细胞等作用；LDH 参与机体能量代谢，分布在各个组织中，当机体组织受损或坏死的时候，释放LDH进入血液，血液中的LDH活力升高；CK与细胞内能量转运、ATP 再生、肌肉收缩有直接关系。 本研究体内实验发现大果木姜子高、中、低剂量都能不同程度的升高GSH和T-AOC，发挥抗氧化的作用，并能降低CK和 LDH 的活力。综上所述，大果木姜子具有心肌保护作用，但是高、中、低剂量没有呈现剂量依赖性，以低剂量效果最突出。其机制可能与调控氧化应激，保护细胞损伤和抗氧化系统相关。