地龙提取物抗肺纤维化的有效成分分析

陈宏，张伟，郭建波，宋倩男，王伟明

(1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

肺纤维化是最常见的肺间质疾病，也是呼吸系统最严重的疾病之一[1]。随着空气污染日益严重，雾霾的频发，发病率也正在逐步提高。肺纤维化目前治疗药物匮乏，患者的死亡率高,统计数据表明，肺纤维化患者的病死率要高于很多肿瘤患者[2-3]，患者最终会因呼吸衰竭而死亡，因此寻找肺纤维化治疗药物具有重要的意义。本课题组通过动物模型对地龙提取物抗肺纤维化的有效成分进行分析，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性小鼠60只，体质量18～22 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

1.2 主要试剂及药物

盐酸平阳霉素(盐酸博莱霉素)，8 mg/支，哈尔滨博莱制药有限公司生产；羟脯氨酸测试盒，哈尔滨佰亿成生物科技发展有限公司;地龙饮片，由本院中药饮片室提供。

1.3 方法

1.3.1 模型的制备

小鼠购回后于室温20 ℃，自然光照条件下适应性饲养1周。采用博莱霉素气管内注入法复制大鼠肺纤维化模型。采用暴露式气管内注入法，待麻醉后将大鼠仰卧固定，消毒并切开颈部皮肤，逐层钝性分离软组织，暴露气管,给予盐酸平阳霉素，给药量为8.5 mg/kg，正常对照组手术方法相同，气管内注入等量生理盐水。

1.3.2 分组与处理

60只小鼠采用随机数字表随机分为正常对照组、模型组和地龙组。地龙组于造模后第2日起给予地龙水提物1.45 g/(kg·d)灌胃；正常对照组、模型组给予等容积生理盐灌胃。共饲养4周，取材分7 d、28 d两个时间点进行，每次每组10只动物。取右肺下叶组织，用4%的甲醛溶液固定2 d后，做病理检查。取右肺中叶组织0.02 g，于-20 ℃冰箱保存，备测羟脯氨酸(NYP)含量。

1.3.3 指标的测定

肺系数=肺重/体质量；肺组织病理改变；肺组织HYP含量测定(碱水解法)。实验重复3次。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组肺系数变化情况比较

地龙组与模型组比较，肺指数明显降低(P<0.05)；7 d时，模型组、地龙组的肺系数与正常对照组比较，P<0.05，地龙组与模型组比较，P>0.05；28 d时，正常对照组、地龙组与模型组比较，P<0.05。结果如表1所示。

表1 各组肺系数变化的比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

2.2 各组肺病理形态学变化

光镜下，正常对照组肺组织结构清晰，无明显炎症；其他3组在7 d时均出现明显的炎症反应，大量炎细胞浸润，细胞间隔水肿增厚，各组间镜下差异不明显；28 d除正常对照组外，各组均有不同程度的纤维化改变，纤维组织增生间隔增宽，模型对照组尤为严重，地龙组显示轻度纤维化改变。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理改变(HE，×200)

2.3 各组肺组织匀浆羟脯氨酸的测定

7 d时，模型组与对照组相比差异明显(P<0.05)，28 d时，地龙组和正常对照组比较差异明显，具有统计意义(P<0.05)，与模型组比较也具有统计学意义(P<0.05)。结果如表2所示。

表2 各组肺组织匀浆羟脯氨酸的测定结果比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05。

3 讨论

肺纤维化是间质性肺疾病(ILD) 常见的临床病理改变；以成纤维细胞的大量增殖及细胞外基质聚集为主要病变特征；呼吸衰竭是肺纤维化患者的最终临床表现[4]。患者的中位生存时间为2～3年，5年病死率达到40%，自然缓解率非常低 (<1%)[5-6]。纤维化的致病因素广泛，空气污染、各种粉尘、射线损伤、某些药物和疾病等均可以引起肺纤维化；查不出病因的肺纤维化患者，称之为特发性肺纤维化[7]。

肺部间质组织发炎的原因包括空气污染物、过敏原、细菌或病毒、吸入有毒气体、空气微粒以及香烟等。当肺部组织受到刺激，造成免疫反应发生，大量白细胞自肺部微血管浸润至肺组织中，分泌许多炎性因子[8]：TNF-α、IL-6、IL-8，白细胞分泌的炎性因子会吸引更多的白细胞浸润，使得发炎症反应加剧，而白细胞分泌的蛋白酶会伤害肺部组织。肺纤维化是由于肺脏受到伤害后，在修复的过程中失调，肌纤维细胞及胶原蛋白过度增生，使肺部间质形成大量纤维结缔组织。肺部纤维化典型症状主要有呼吸困难、逐渐恶化之呼吸急促和干咳。肺部纤维化早期咳嗽无痰，中晚期之后会有少量黏痰，且易出现继发感染，痰液会出现脓痰或血痰。肺纤维化可分为继发性和特发性，继发性肺纤维化是由于其他疾病导致的二次反应，如[9]：自体免疫疾病、肺部感染细菌或病毒、接受放射线治疗等，特发性肺纤维化是致病原因不明。肺纤维化疾病特征为肺泡组织破坏并伴随着纤维母细胞/肌纤维母细胞异常增生和细胞外基质的过度合成与堆积。另外近几年研究证实，氧化压力是造成肺纤维化的机制之一，在肺纤维患者的肺纤维细胞中NADPH oxidase4(NOX4)表现量比正常人多，且NOX4是TGF-1促进纤维细胞转分化的重要因子。

最近的药理学研究表明，地龙具有退热作用，可减轻支气管平滑肌痉挛，抗纤维原性。在许多研究中证实了地龙在不同刺激下的疾病模式中，在不同的器官具有抗发炎及氧化压力的效用，即便如此，在肺部发炎相关疾病的模式中其保护效果仍尚未清楚，且作用机转也须更进一步研究。虽然地龙对肺纤维化治疗作用已有文献报道[10]，但是对其药效研究尤其是在多种肺纤维化模型上的评价并没有系统研究，此外，其治疗肺纤维化的分子机制也尚未被阐明，这一定程度上限制了该药物的在肺纤维化治疗上的应用。本文通过建立博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型，模拟致病因素导致的肺纤维化；利用模型对地龙提取物进行全面的药效学检测，寻找药物的敏感模型，本研究表明，地龙组与模型组比较，肺指数明显降低(P<0.05)；病理结果明显好于模型对照组；HYP含量也明显降低(P<0.05)。因此，地龙提取物可不同程度改善博莱霉素所致的小鼠肺纤维，通过研究能够为临床上针对不同类型的肺纤维化患者的合理使用提供数据支持。