益肾健脾利湿方对乙硫氨酸诱导的非酒精性脂肪肝小鼠的保护作用

李先行，杜昊炎

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.商丘市中医院，河南 商丘 476000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损伤因素外所导致的肝病，以弥漫性肝细胞脂肪变性为主要特征[1-3]，是一种全身性代谢综合征。除肝脂肪变性外，NAFLD患者无其他明显的临床症状，但具有发展为非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭及肝细胞癌的潜在风险[4-6]。目前导致NAFLD脂质代谢异常的相关机制尚未明确，但其发生与心脑血管疾病、中心性肥胖、糖尿病及脂质代谢紊乱有关[7]，临床上暂无特异有效的治疗方法。目前NAFLD的治疗药物以减肥降脂药、胰岛素抵抗药和护肝药为主，不良反应较多[8]，而中医药治疗NAFLD因治法完备、不良反应少，越来越受到广泛关注。益肾健脾利湿方由茵陈蒿汤、六味地黄丸加参苓白术散组成，具有清热利湿、补益肝肾之功效。本实验以昆明种小鼠为对象，探讨益肾健脾利湿方对乙硫氨酸诱导的NAFLD小鼠的保护作用及其可能的作用机制，为益肾健脾利湿方对NAFLD的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级昆明种小鼠40只，体质量(20±2)g，购自河南省实验动物中心，合格证号：SCXK(豫)2015-0004，根据随机分组法分为4组，分别为正常对照组、脂肪肝模型组、益肾健脾利湿方组和二甲双胍组，每组10只，所有小鼠饲养于河南中医药大学动物实验中心，自由采食饮水。

1.2 主要仪器

HC-2064型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；DZKW-C型电子恒温水浴锅(余姚布亚星仪器仪表有限公司)；XH-D型涡旋混匀器(江苏康健医疗用品有限公司)；MULTISKAN FC型酶标仪(上海赛默飞世尔仪器有限公司)；723型可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；BSA224S型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.3 实验药品与试剂

DL-乙硫氨酸(上海麦克林生化科技有限公司)；盐酸二甲双胍片(上海上药信谊药厂有限公司)；总胆固醇(TC)测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；甘油三酯(TG)测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)；实验所用中药材均购自郑州市张仲景大药房。

1.4 脂肪肝模型的建立

40只小鼠适应性喂养后，脂肪肝模型组、益肾健脾利湿方组和二甲双胍组小鼠灌胃DL-乙硫氨酸250 mg/kg(2.5%的溶液给药体积为10 mL/kg)，1次/d，连续7 d，制备非酒精性脂肪肝模型，正常对照组小鼠灌胃等体积生理盐水。

1.5 中药制备及给药

益肾健脾利湿方组方：茵陈30 g,大黄9 g,栀子9 g,柴胡15 g,白术10 g,丹参30 g,山药12 g,茯苓9 g,泽泻9 g,熟地黄15 g,枸杞子9 g,淫羊藿9 g,鸡血藤15 g,甘草6 g和大枣6枚。浓缩成1 g生药/mL的溶液备用。中药给药剂量根据公式S小鼠/20 g=0.002 6×S人/70 kg，得出益肾健脾利湿方给药剂量(口服剂量)为小鼠0.486 2 g/20 g(人为187 g/70 kg)，即灌胃剂量为24.31 g/kg/小鼠。因此益肾健脾利湿方组小鼠按24.31 g/kg(含生药1 g/mL)剂量灌胃益肾健脾利湿方水煎液，2次/d，连续14 d。

二甲双胍组小鼠按剂量150 mg/kg(0.62%的二甲双胍给药体积为24.31 mL/ kg)灌胃二甲双胍，2次/d，连续14 d。

按照等量不等浓度的原则，正常对照组和脂肪肝模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 血清中TC、TG、ALT、AST含量测定

各组小鼠均在末次给药6 h后摘取眼球取血，3 000 r/min离心20 min，取血清，用试剂盒测定各组小鼠血清中ALT、AST、TC、TG含量，测试步骤按说明书进行。

1.6.2 肝脏系数测定

末次给药后，各组小鼠颈椎脱臼处死，解剖取肝脏，称重，按照下列公式计算肝脏系数。

肝脏系数(%)=肝脏湿重/小鼠体质量×100%

1.6.3 肝脏匀浆中TC、TG含量测定

取“1.6.2”项下小鼠肝脏相同部位的肝组织100 mg，以2 mL丙酮—乙醇混合液(1∶1)研磨制备匀浆，抽提脂质，离心取上清液，用试剂盒测定肝脏中TC、TG含量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏系数测定结果

脂肪肝模型组小鼠肝脏系数显著高于正常对照组(P<0.01)；益肾健脾利湿方组和二甲双胍组小鼠肝脏系数显著低于脂肪肝模型组(P<0.01)。结果见表1。

表1 各组小鼠肝脏系数比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与脂肪肝模型组比较，bP<0.01。

2.2 各组小鼠肝脏组织中TC、TG含量测定结果

脂肪肝模型小鼠肝脏组织匀浆中TC、TG含量显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01)；益肾健脾利湿方组和二甲双胍组小鼠肝脏组织中TC、TG含量显著低于脂肪肝模型组(P<0.01)。结果见表2。

表2 各组小鼠肝脏组织匀浆中TC、TG含量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与脂肪肝模型组比较，bP<0.01。

2.3 各组小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量测定结果

脂肪肝模型小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量显著高于正常对照组(P<0.01)；益肾健脾利湿方组和二甲双胍组小鼠血清中TC、TG、ALT、AST含量显著低于脂肪肝模型组(P<0.01)。结果见表3、表4。

表3 各组小鼠血清中TC、TG含量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与脂肪肝模型组比较，bP<0.01。

表4 各组小鼠血清中ALT、AST含量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与脂肪肝模型组比较，bP<0.01。

3 讨论

肝脏是碳水化合物、脂肪和蛋白质的合成与水解的主要场所，任何导致脂肪代谢紊乱的因素均可致肝脏脂肪异位沉积，形成脂肪肝，其中非酒精性脂肪肝发展迅速，易从单纯性脂肪肝演变成脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌[9-11]，严重威胁人类健康。因此对酒精性脂肪肝的研究与治疗具有重要意义。肝脏TG输出不足可引起脂质大量堆积导致脂肪肝，而乙硫氨酸与甲硫氨酸结构相似，可与之竞争取代甲基而提供乙基致使肝脏蛋白合成障碍，载脂蛋白合成减少，TG蓄积于肝脏而形成脂肪肝[12-13]。本实验采用乙硫氨酸诱导构建小鼠NAFLD模型，结果显示脂肪肝模型组小鼠肝脏系数显著高于正常对照组，提示建模成功。

目前治疗非酒精性脂肪肝的药物主要有减肥药、胰岛素增敏剂、肝细胞保护剂、调血脂药、抗氧化剂等[14]，这些药物往往存在下肢轻度水肿、转氨酶增高及肝脏毒性等不良反应。益肾健脾利湿方由茵陈蒿汤、六味地黄丸加参苓白术散组成，其中茵陈蒿汤出自《金匮要略》，主治湿热停聚导致的阳黄，原文为“谷疸之为病，寒热不食，食即头眩，心胸不安，久久发黄，为谷疸，茵陈蒿汤主之”，其症“身黄如橘子色”与脂肪性肝炎具有相同的临床表现，有研究表明茵陈蒿汤能够有效改善NAFLD；六味地黄丸出自《小儿药证直诀》，具有调节免疫和钙磷代谢、降血糖、降血脂、保护肝脏等多种作用；参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，为中医治疗脾虚证的经典方剂，具有调节肝脏脂质代谢、降低肝脂和减轻肝脏损伤的作用[15-18]。本实验结果显示益肾健脾利湿方组小鼠肝脏系数显著低于脂肪肝模型组，表明益肾健脾利湿方对乙硫氨酸诱导的非酒精性脂肪肝具有保护作用。

TC是所有脂蛋白所含胆固醇的总和，包括游离胆固醇和胆固醇脂，主要合成和贮存于肝脏，其含量可作为脂代谢的主要指标；TG主要在肝脏和脂肪组织中合成，是机体储存能量的重要形式。由于肝脏脂肪化，其氧化分解能力降低，脂肪合成增多，机体TC、TG水平呈现不同程度的升高。ALT和AST主要存在于肝细胞和心肌细胞内，血清中较少，当肝细胞膜通透性增加或严重受损时，ALT和AST被释放入血液，血清中ALT和AST水平就会升高[19-21]。本实验测定了小鼠肝脏组织中TC、TG含量和血清中TC、TG、ALT、AST含量，结果显示脂肪肝模型小鼠肝脏组织中TC、TG含量和血清中TC、TG、ALT、AST含量显著升高，益肾健脾利湿方可显著降低肝脏组织中TC、TG含量和血清中TC、TG、ALT、AST含量，从而起到对NAFLD的保护作用。

综上所述，益肾健脾利湿方对小鼠NAFLD具有保护作用，可降低肝脏系数，其保护作用可能通过降低肝脏组织中TC、TG水平和血清中TC、TG、ALT、AST水平等途径来实现。益肾健脾利湿方(茵陈、大黄、栀子、柴胡、白术、丹参、山药、茯苓、泽泻、熟地黄、枸杞子、淫羊藿、鸡血藤、甘草和大枣)由茵陈蒿汤、六味地黄丸加参苓白术散组成，具有健脾利湿、疏肝活血之功效，用于在NAFLD疗效显著，本研究为临床应用提供实验依据，利于临床推广使用。