肠康方对腹泻型肠易激综合征模型大鼠肥大细胞的影响

任杰，樊欣钰，范志巍，江晟，陆敏,2*

(1.南京中医药大学第三临床医学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028)

肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS) 是一种以反复腹痛，伴排便习惯改变或大便性状异常为临床征象的功能性肠病[1]。临床上主要分为腹泻型、便秘型、混合型和不定型4种类型[2]。其中腹泻型(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)是最常见类型，有研究表明其占总肠易激综合征患者的74%[3]。

现代医学目前尚无完全有效的治疗方法。近年来，中医药以其独特诊疗理念，在IBS的治疗上发挥了很大优势[4-5]。肠康方是全国名老中医王德明教授在多年的临证过程中逐渐总结形成的验方，对IBS的治疗具有独特的疗效，对IBS-D疗效尤为显著。为探讨肠康方对IBS-D疗效作用的可能机制，通过建立的IBS-D大鼠模型，观察其对模型大鼠结肠肥大细胞的影响。

1 材料

1.1 实验动物

上海西普尔必凯实验动物有限公司提供的SD孕鼠，合格证号：SCXK (沪)2008-0016，于江苏省中西医结合医院SPF级实验动物中心喂养，室温22 ℃～26 ℃，自然光照条件，大鼠自由进食。

1.2 实验药物

番泻叶由江苏省中西医结合医院中药房提供。肠康方组方：白芍15 g，防风6 g，熟地黄5 g，菟丝子5 g，黄连3 g，金荞麦8 g，蝉蜕3 g；由江苏省中西医结合医院中药房提供。匹维溴铵(Abbott Products SAS，规格：50 mg/片，批号：H20120127)。

1.3 实验试剂

甲苯胺蓝(南京群相生物科技有限公司)；10%甲醛(江苏省中西医结合医院病理科提供)；5-HT免疫组化试剂盒(上海优宁维生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

参考AL-Chaer造模方法[6]并进行改良，采用新生期结直肠刺激联合成年后番泻叶灌胃方法造模，建立IBS-D大鼠模型。SD孕鼠，单独饲养，待其生产。选取新生大鼠120只，采用随机数字法分为造模组105只和空白对照组15只。

2.1.1 新生期结直肠刺激

分别在造模组幼鼠出生第8、10、12天进行结直肠刺激，将经皮冠状动脉成形术球囊经肛门插入结直肠，球囊完全进入后，向球囊内注气，使球囊内压强为60 mm Hg(1 mm Hg≈0.133 kPa),持续1 min，每日1次，共3次。刺激后与母鼠共同饲养至第22天断奶。第30天分笼，正常饲养。出生第60天，进行AWR检测，筛选出肠道高敏感大鼠，进行下一步造模。空白对照组不作任何处理。

2.1.2 番泻叶水灌胃

将番泻叶放入5倍体积的开水中浸泡一夜。过滤后取滤液，将其浓缩至浓度为0.45 g/mL。对筛选出的肠道高敏感大鼠，给予浓度为0.45 g/mL番泻叶水灌胃，灌胃体积为10 mL/kg，每日1次，持续2周。空白对照组不作任何处理。

2.2 动物分组

造模结束后，将造模成功的75只大鼠，随机分成5组，分别为模型对照组、阳性药物组、肠康方高剂量组、肠康方中剂量组和肠康方低剂量组，每组各15只。

2.3 药物干预

按照动物实验研究等效剂量的计算方法，即按60 kg/200 g人鼠转换系数w=6.25计算等效剂量，肠康方高、中、低剂量组分别18.75、9.38、4.69 g/(kg·d)的剂量灌胃。阳性药物组以匹维溴铵悬浮液按照15 mg/(kg·d)的剂量灌胃。空白对照组和模型对照组给予等容积的蒸馏水灌胃。每天上午9时灌胃，1次/d，持续2周。

2.4 模型评价

2.4.1 大鼠一般情况

观察各组大鼠的精神状态、毛发色泽、活动情况等。

2.4.2 大鼠排便情况

观察各组大鼠造模后及药物干预后的排便情况。

2.4.3 腹壁撤退反射(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)

AWR用于评估内脏敏感性变化，是评价内脏痛的可靠指标。操作如下：实验前禁食12 h，将大鼠放入自制的玻璃容器中，使其只能前后运动。将8F导尿管自肛门出入，待球囊末端深入肛门1 cm为止。待大鼠平稳安静后，向导尿管内注气，使球囊内压强分别为10 mm Hg，20 mm Hg，40 mm Hg，60 mm Hg，80 mm Hg。每个压强持续20 s，观察大鼠在各个压强下的反应，对其进行评分。每个压力值检测3次，取其平均值。具体评分标准参照文献[7]，0分：无行为反应；1分：身体静止不动，头部短暂运动；2分：腹部肌肉收缩，但未抬离底面；3分：腹肌收缩并抬抬起；4分：骨盆抬起，身体呈弓形。

2.5 指标检测及方法

2.5.1 肥大细胞(mast cells，MC)计数

药物干预14 d后，禁食不禁水24 h，将各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉。剖腹，从距离回盲连接处2 cm开始向肛门方向取结肠1 cm，投入10%中性甲醛溶液固定，切片行甲苯胺蓝染色，光镜下计数肥大细胞数目。

2.5.2 5-HT平均光密度值

紧邻上一段另取一段约1 cm结肠，甲醛固定，石蜡包埋，切片后行5-HT免疫组化染色。免疫组化染色后，以细胞核出现棕黄色染色颗粒为阳性反应，无棕黄染色为阴性。应用Image Pro Plus 软件测定其阳性表达的光密度(optical density，OD)值进行半定量分析，以测定结肠黏膜5-HT水平。棕黄染色越多，OD值越大，5-HT水平越高。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 一般情况

空白对照组大鼠精神良好，毛发光泽，饮食正常。模型对照组大鼠精神状态较差，活动减少，毛发失去光泽，饮食减少。药物干预组大鼠，经肠康方及匹维溴铵药物干预后，精神逐渐恢复正常，活动增加，毛发逐渐恢复光泽，饮食增加。

3.2 大鼠排便情况

空白对照组大鼠粪便正常，模型对照组大鼠造模后粪便变软，或成稀状，经肠康方及匹维溴铵药物干预后，腹泻逐渐消失，粪便逐渐恢复正常。

3.3 腹壁撤退反射(AWR)

药物干预结束后，用AWR评估各组大鼠的内脏敏感性。与空白对照组相比，模型对照组大鼠在不同球囊压力的AWR的评分均升高，有统计学意义(P<0.05),说明模型对照组大鼠内脏呈高敏感。与模型对照组相比，阳性药物组和肠康方高、中、低剂量组大鼠在不同球囊压力的AWR的评分均降低(P<0.05),说明阳性药物组和肠康方高、中、低剂量组大鼠内脏高敏感有所缓解，匹维溴铵和肠康方均可降低IBS-D模型大鼠AWR评分。见表1。

表1 各组大鼠AWR评分比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与模型对照组相比，#P<0.05。

3.4 大鼠结肠黏膜MC计数

MC经甲苯胺蓝染色后，显微镜下观察，发现MC主要分布在黏膜下层及黏膜固有层，MC胞核呈蓝色，胞质紫红色。与空白组相比，模型对照组大鼠结肠黏膜MC数量显著增多(P<0.01)。与模型对照组相比，肠康方高、中、低剂量组大鼠结肠黏膜MC数量均显著减少(P<0.01)。提示肠康方高有减少IBS-D模型大鼠结肠MC的作用。见表2、图1。

表2 各组大鼠结肠肥大细胞计数个)

注：与空白对照组相比，*P<0.01；与模型对照组相比，#P<0.01。

图1 各组大鼠肠肥大细胞情况(甲苯胺蓝染色，×400)

3.5 大鼠结肠黏膜5-HT水平

结肠黏膜行5-HT免疫组化染色后，显微镜下观察，每个标本随机选取5个视野，每个视野截取图像，采用Image Pro Plus 软件分别测定其OD值，取其平均值，作为该标本的平均值。模型对照组OD值明显升高，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)，说明模型对照组大鼠结肠黏膜5-HT水平明显高于空白对照组大鼠。肠康方高、中、低剂量组OD值显著低于模型对照组(P<0.01)，说明肠康方高、中、低剂量组大鼠肠黏膜5-HT水平显著低于模型对照组。见表3、图2。

表3 各组大鼠结肠黏膜5-HT OD值比较

注：与空白对照组相比，*P<0.01；与模型对照组相比，#P<0.01。

图2 各组大鼠结肠黏膜5-HT水平(免疫组化染色，×200)

4 讨论

IBS的病理机制目前尚未完全清楚，主要包括内脏高敏感、脑肠轴异常、消化道感染、胃肠动力异常以及精神心理等多方面因素，极为复杂[8]。近年来，随着对IBS-D的研究不断深入，发现脑-肠互动机制在IBS-D发病过程中起到了重要作用，并针对此机制提出了“脑-肠轴”的概念[2]。参与脑-肠互动机制的神经递质称为脑肠肽，主要有5-HT、血管活性肠多肽(VIP)、P物质(SP)、降钙素基因相关肽(cGRP)等。其中5-HT是脑肠轴中最主要的神经递质，而人体内大部分的5-HT来源于胃肠道。

肠MC是合成、分泌和储存5-HT的功能细胞[9]，在脑肠轴信息传递及内脏高敏感的形成中发挥着重要的作用[10-11]。MC 主要位于肠黏膜固有层下的神经和血管附近，是神经-免疫调节系统的重要组成部分[12]。正常状态下，MC 不会被激活，当发生应激后，MC脱颗粒活化，释放多种活性物质，进而降低内脏感觉阈值[13]。5-HT是MC脱颗粒释放的重要活性介质之一，与消化道的运动、分泌与吸收以及内脏感觉均有着密切关系[14]。有研究表明，当患者患有IBS-D时，其肠黏膜中MC数量增多，血浆5-HT水平增高，同时在肠黏膜MC周围，5-HT免疫阳性的神经纤维表达亦增强[15]。5-HT通过激活5-HT受体，将信号由内脏传入神经及肠神经系统，并传入神经中枢，进而导致大脑对痛觉高敏感[16]。由此可见，通过调节5-HT，肠MC在IBS-D的发病过程中发挥了重要作用。

本研究结果显示,肠康方能够明显改善IBS-D模型大鼠的腹泻症状，明显降低其AWR评分(P<0.05)，改善其肠道高敏感状态。同时，肠康方能够明显减少IBS-D模型大鼠结肠MC的数量，说明结肠MC数量的变化与IBS-D的发生密切相关，与文献报道相符。不同剂量的肠康方均能减少IBS-D模型大鼠结肠MC的数量(P<0.01)。虽然组间比较不同剂量组之间未显示出统计学差异，但高、中、低剂量组从数值变化上，表现出对MC数量的影响呈降低趋势，并以高剂量组为优。说明随着给药剂量的增加，肠康方对IBS-D模型大鼠肠MC作用逐渐增强。另外，肠康方能明显降低模型大鼠结肠黏膜5-HT水平，说明结肠5-HT水平的变化亦与IBS-D的发生密切相关，与文献报道相符。而结肠黏膜5-HT水平的变化与结肠MC的数量变化相一致，说明肠康方治疗IBS-D的作用机制可能同时与MC和5-HT有关。

根据IBS-D的主要临床表现，可将其归属于“腹痛”“泄泻”等范畴，其病位涉及肝、心、脾、胃、肾、大小肠等脏腑。王德明教授认为IBS-D主要病机是脾虚肝郁、心肾不交。其创制的肠康方，以白芍、防风为君药，养血柔肝、散肝舒脾，使疏肝也能达到脾健的效用；熟地黄、菟丝子、黄连为臣药，滋肾阴、补肾阳、清心火，三药同用，则心肾交通，阴平阳治，滋水涵木，情志得遂；金荞麦、蝉蜕为佐药，清肺热、疏风解痉，肺合大肠，肺降则肠安。全方诸药合用，共奏调和肝脾、交通心肾、缓痛止泻、宁神畅情之功。

综上所述，肠康方对IBS-D的疗效显著，其作用机制可能是通过对肠黏膜MC的调控，进而调控脑肠轴中5-HT信号系统，降低5-HT的浓度，以改善大鼠肠道高敏感状态。