响应面法优化黄精总蛋白提取工艺及其氨基酸含量

王远茜，陈艳艳，宋宸宇，白雪媛，王思明*

1. 长春中医药大学（长春 130117）；2. 吉林省肿瘤医院康复中心（长春 130012）

黄精（Polygonatum sibiricumRed.）为百合科（Liliaceae）黄精属（PolygonatumMill.）滇黄精、多花黄精的干燥根状茎。按其形状，通常又被称为鸡头黄精、仙人余粮、老虎姜等。自然条件下，黄精最适合生长于表层水分丰富、富含腐蚀质的沙质土壤以及荫蔽高海拔地区[1]。

药用黄精在药食同源方面以及健康保健领域的作用愈发突出，具备广泛的药用价值、重要的研究意义。较多报道针对黄精多糖等[2-5]成分进行研究，中医古籍记载鲜黄精具有补益作用，因此考察黄精总蛋白是否具有一定的生物学活性。此次试验主要考察报道较少的黄精蛋白提取工艺[6]。基于基础研究发现，在碱提液中黄精蛋白的溶出率较水提液高，试验采用碱液提取的方法提取黄精总蛋白，因此试验从pH为7开始考察，所得出的试验结果也验证了这一结论。

响应面方法（Response surface methology，简称RSM）是数学方法和统计方法结合的产物，是用来对所感兴趣的响应受多个变量影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化该响应值。比正交试验的方法更加可信、详细与准确[7]。

1 试验材料及仪器

1.1 材料与试剂

鲜黄精（湖南湘西）；NaOH（北京化工厂，分析纯）；HCl（北京化工厂，分析纯）；Bradford蛋白定量试剂盒（天根，TIANGEN）；磷酸盐缓冲液（PBS，由长春中医药大学人参科学研究院中医药大健康产业中心配制）。

1.2 试验仪器与设备

FE20 pH计（美国梅特勒-托利多公司）；Gentrifuge 5804R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Infinite M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；AL204电子天平（美国梅特勒-托利多公司）；全营养蔬果破壁机；电子精密分析天平。

2 试验方法与结果

2.1 蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。将牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，分别吸取0，1，2，3，4，5和6 μL BSA标准溶液进行试验，使用酶标仪来测定吸光度，以蛋白质的质量浓度（μg/μL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线。所建立的回归方程为：Y=0.077 9X+0.008 3（R2=0.998 4）。蛋白质标准曲线见图1。

图1 蛋白质标准曲线

2.2 黄精蛋白单因素试验

以黄精蛋白提取率为衡量指标，分别以pH、提取时间、料液比、提取次数为影响因素以设计黄精蛋白单因素试验[8]。

2.2.1 黄精蛋白等电点的确定

精密称取黄精6份，每份20.00 g，按料液比1∶5（g/mL）将碱提取液（pH 9）放置于4 ℃冰箱浸提，过滤之后用HCl分别调pH至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，酸沉4 h[9]，提取次数1次，沉淀离心后冻干，分别称定不同pH条件下各个样品蛋白质的含量，含量最多的即为等电点，试验中酸沉的pH 3.5为黄精的等电点[10]。

由图2可以看出，当pH＜3.5时，蛋白提取率随着pH的增加而逐渐上升；当pH为3.5时，黄精蛋白含量最高，此时酸沉效果最好；当pH＞3.5时，随着pH的增加，蛋白质的提取率降低。综上可知，pH 3.5为黄精的等电点[11]。

图2 等电点pH与提取率的关系

2.2.2 碱提pH对黄精蛋白提取率的影响

取20 g鲜黄精，在料液比1∶5（g/mL），pH分别为7，8，9，10和11的条件下放置于4 ℃冰箱浸提4 h，过滤之后用HCl分别调pH至3.5，过滤后再离心，取上清液密封保存，然后使用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[12]。

由图3可知，蛋白质的提取率在pH 9时最高，在pH 9之前蛋白提取率随着pH增大而增加，pH 10时所提取蛋白含量减少，故选择pH 9作为最后提取的pH。

图3 碱液pH与提取率的关系

2.2.3 料液比对黄精蛋白提取率的影响

取20 g鲜黄精，在pH 9，料液比分别为1∶3，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）的条件下放置于4℃冰箱浸提4 h，过滤之后用HCl分别调pH至3.5，过滤后再离心，取上清液密封保存，蛋白质含量使用考马斯亮蓝法测定。

由图4可知，料液比1∶5（g/mL）时蛋白提取率最高，之后随着提取液体积增大提取率逐渐下降[13]。

2.2.4 提取时间对黄精蛋白提取率的影响

取20 g鲜黄精，在pH 9，料液比1∶5（g/mL）的条件下，分别碱提2，4，8，12和24 h，过滤之后用HCl分别调pH至3.5，过滤后再离心，取上清液密封保存，然后使用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

由图5可以明确看出，当提取时间为4 h时，黄精蛋白提取效果最好。在4 h前，黄精蛋白随着提取时间延长溶出较多，在4 h时达到最大，4 h后的提取率逐步趋于平缓，分析原因可能是随着提取时间的增长[14]，有效成分溶出量达到饱和，故试验选择4 h作为最佳提取方案。

图4 不同料液比对提取率的影响

图5 提取时间对提取率的影响

2.2.5 提取次数对黄精蛋白提取率的影响

取20 g鲜黄精，在pH 9，料液比1∶5（g/mL）的条件下碱提4 h，分别提取1，2和3次，过滤之后用HCl分别调pH至3.5，过滤后再离心，取上清液密封保存，蛋白质含量使用考马斯亮蓝法测定。

由图6可以看出，提取2次较提取1次提取率增大，之后随着提取次数的增加，蛋白的提取率没有太大变化，同时考虑到成本及工作效率的因素，提取次数确定为2次。

图6 不同提取次数对提取率的影响

2.3 蛋白提取条件的响应面试验设计

在单因素试验的基础上，采用Design Export 8.0.6的Box-Behnken中心组合试验设计响应原理，进行响应面试验设计，每个组合平行3次，提取率取平均值，因素和水平见表1[15]，试验结果见表2。

表1 响应面试验因素水平

表2 试验方案及结果

2.4 统计学方法

每个样品处理重复3次，结果取平均值。采用Excel 2007进行数据散点图和统计分析。Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计及结果分析。

得拟合方程为：Y=+0.81-0.015A+0.021B+0.083C+0.012D+0.022AB-0.013AD+0.000 02BC-0.000 02BD-0.075CD-0.23A2-0.16B2-0.13C2-0.2D2。

该试验模型的显著性分析见表3。模型F=121.28，Pr＞F＜0.000 1，说明此回归模型是极显著的。方程失拟项F=0.916 4，Pr＞F＞0.05，失拟项相对于纯误差影响不显著，说明回归模型与实测值拟合度较好，可以使用该回归方程代替试验真实点分析试验结果。各因素的影响大小为：提取次数＞提取时间＞料液比＞pH。通过F检验来判定，概率P（F＞Fα）的值越小，则相应变量的显著程度越高，对试验指标的影响越大，PB、PC均小于0.01，说明提取时间、提取次数对黄精蛋白提取率的影响极显著。

表3 响应面试验方差分析

表4 回归模型方差分析

2.5 响应面结果分析

利用Design Expert 8.0.6，根据回归方程，生成等高线和响应面图，并考察拟合响应曲面的形状，分析pH、液料比、提取时间、提取次数对黄精蛋白提取率的影响。

从图7～图12可见，四个因素在所选范围内存在极值，即等高线中最小椭圆的中心点。图10中，CD交互作用显著，与F值结果一致。

图7 提取时间与提取次数交互作用的响应面和等高线图

图8 提取时间与料液比交互作用的响应面和等高线图

图9 提取次数与料液比交互作用的响应面和等高线图

图10 提取次数与pH交互作用的响应面和等高线图

图11 pH与料液比交互作用的响应面和等高线图

图12 pH与提取时间比交互作用的响应面和等高线图

2.6 验证试验

经软件分析优化，由该模型得到的最佳优化条件为：料液比1∶5.587（g/mL）、提取时间3.494 h、提取次数1.832次、pH 9.673。且预测黄精蛋白提取率理论值为0.57%。考虑到实际操作的可能性，将试验条件修正为：料液比为1∶5.6（g/mL）、提取时间3.5 h、提取次数2次、pH 9.7。在该修正条件下进行3次提取试验，平均蛋白质提取率为0.51%，接近理论值。表明该数学模型可用于优化黄精蛋白质提取过程。

2.7 高效液相色谱法测定黄精中氨基酸的方法与结果

采用高效液相色谱法，对黄精冻干品中所含氨基酸进行测定[16]。分别将各种必需或非必需的氨基酸进针，通过对比总氨基酸液相图和黄精蛋白冻干品液相图相同的保留时间峰可以得到黄精所含的氨基酸的种类。

2.7.1 色谱条件

色谱柱，GL Sciences WP 300 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A，甲醇；流动相B，0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液。样品采用梯度洗脱程序，洗脱量见表5。流速1.0 mL·min-1，紫外检测波长360 nm，柱温20 ℃，进样量10 μL。

表5 柱前衍生化高效液相指纹图谱流动相洗脱程序

2.7.2 供试品溶液的制备

取0.1 g黄精冻干粉，使用流动相溶解黄精冻干粉，精密量取2 mL续滤液置于5 mL冻干管中，再加入1 mL的1.5%（质量分数）的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL浓度为0.5 mol·L-1NaHCO3，振荡摇匀，在60 ℃鼓风烘箱中避光反应1 h，取出，冷却，再加浓度为0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液至5 mL定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.7.3 阴性对照品的制备

精密量取2 mL蒸馏水置于5 mL冻干管中，再加入1 mL的1.5%（质量分数）的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL浓度为0.5 mol·L-1NaHCO3，振荡摇匀，在60 ℃鼓风烘箱中避光反应1 h，取出，冷却，再加浓度为0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液至5 mL，定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为衍生剂阴性对照品溶液。

2.7.4 对照品溶液的制备

分别称取约10 mg各氨基酸对照品，精密称定，置于10 mL冻干管中，加蒸馏水至10 mL，得到浓度为1 g·L-1的氨基酸对照品溶液。对各氨基酸对照品溶液进行衍生化，取2 mL各氨基酸对照品溶液置于5 mL冻干管中，再加入1 mL的质量分数1.5%的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL浓度为0.5 mol·L-1NaHCO3，振荡摇匀，在60 ℃鼓风烘箱中避光反应1 h，取出，冷却，再加入浓度为0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液至5 mL定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为氨基酸对照品溶液。

图13 混合氨基酸色谱图

图14 黄精色谱图

图15 空白色谱图

由图13～图15可以看出，黄精中所含氨基酸有：丝氨酸（保留时间17.903 min）、苏氨酸（保留时间25.335 min）、脯氨酸（保留时间32.235 min）、缬氨酸（保留时间53.187 min）、苯丙氨酸（保留时间58.553 min）、异亮氨酸（保留时间59.312 min）、亮氨酸（保留时间60.029 min）和酪氨酸（保留时间63.904）。

3 结论

试验利用响应面分析，对影响因素及其相互作用进行探讨，优化提取黄精蛋白的提取工艺，其最佳条件为料液比为1∶5.6（g/mL）、提取时间3.5 h、提取次数2次、pH 9.7。在此修正条件下进行3次提取试验，蛋白质提取率的平均值为0.51%，与理论值较为接近，表明该数学模型可用于优化黄精蛋白质提取过程。采用高效液相色谱法分析得出黄精蛋白中含有的氨基酸有丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和酪氨酸。