水通道蛋白1、2、5在膜迷路积水豚鼠耳蜗中的分布及表达研究△

冷辉 刘欣旭 张琦

水通道蛋白(aquaporin,AQP)通常分布于哺乳动物及植物的细胞膜表面，是膜通道蛋白家族的成员,介导不同类型细胞的跨膜水转运。目前已经发现了13种亚型，分别为AQP0～AQP12，他们分布于内耳各个部位，各司其职，共同发挥协同作用[1]。梅尼埃病的病理改变是内耳淋巴液代谢失衡，导致内耳周围渗透压的改变，其原因可能与AQPs等水通道蛋白机能改变有一定关联[2]。AQP0～AQP8对水的通透性较好，而AQP3、AQP7、AQP9对水的通透性较差，相反对油脂与尿素的通透性较好，且AQP1、AQP2、AQP5在内耳表达较为丰富，故本研究选择观察AQP1、AQP2、AQP5在豚鼠内耳膜迷路积水状态下的表达及分布情况，探讨其在内淋巴积液中可能的发生机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选择健康红目豚鼠60只，雌雄各半，反应迅速，动作灵活，随机分为空白组(30只)和模型组(30只)。实验动均购自辽宁长生生物科技有限公司[动物批号：SCXK(京)2016-0003]，常规适应饲养7天。

1.2实验试剂及设备 醋酸去氨加压素(deammonia vasopressin acetate,dDAVP)，购自深圳瀚宇药业股份有限公司，生产批号：102117030。BSA、HRP Goat Anti Rabbit、蛋白、SD-PAGE凝胶试剂盒、超敏ECL化学试剂盒、Western及IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒、BSA、DAB试剂盒、即用型SABC-POD试剂盒。Rabbit anti AQP1 antibody、Rabbit anti AQP2 antibody、Rabbit anti AQP5 antibody、Rabbit anti GAPDH antibody、Primer GAPDH、HRP Goat Anti Rabbit。

-80 ℃超低温冰箱、恒温水浴振荡器、高速电动匀浆器、移液器、电子显微镜、水平摇床、电泳仪、电泳槽、全自动脱水机、低温高速台式离心机、全自动酶标仪、数显式电热恒温干燥箱、凝胶成像分析系统。

1.3实验方法

1.3.1豚鼠耳蜗膜迷路积水造模 采用醋酸去氨加压素造模的方式[3]，模型组予6 μg·kg-1·d-1醋酸加压素连续腹腔注射10 d，空白组以1 ml生理盐水腹腔注射10 d；常规饲养7天后取材。

膜迷路积水的判断标准：正常情况下，耳蜗前庭膜与蜗管成约45°夹角，蜗管面积约占耳蜗总面积的1/3(图1a)；当膜迷路积水时，耳蜗的前庭膜向前庭阶方向突出，同时蜗管的横截面积也相应增加,蜗管面积与耳蜗总面积比值增加。在光学显微镜下，将豚鼠耳蜗切片膜迷路积水的程度分为轻、中、重三度，蜗管面积占总面积的1/3～1/2为轻度积水(图1b)；蜗管面积占总面积的1/2～2/3为中度积水(图1c)；蜗管面积占总面积2/3以上为重度积水(图1d)。模型组豚鼠耳蜗切片均出现不同程度的膜迷路积水，均造模成功，其中轻度6只，中度17只，重度7只；而空白组均未出现膜迷路积水。

1.3.2耳蜗取材 豚鼠经10%水合氯醛麻醉后，剪断胸骨，暴露出心脏，打开颞骨，迅速断头取出听泡，放于固定液中室温固定；10%EDTA脱钙，每日换脱钙液。用于Western-blot及荧光定量PCR的豚鼠，同上法麻醉后迅速直接断头取出听泡，放置于-80 ℃冰箱保存待用。每组各取5只(10耳)分别用于AQP1、AQP2、PQP5的免疫组化染色观察，各5只用于Wstern-blot观察。

1.3.3免疫组化方法检测AQP1、AQP2、AQP5蛋白在耳蜗的分布 耳蜗组织固定脱钙后，石蜡包埋，制备好耳蜗组织切片，长度5 μm。随后进行脱蜡、抗原修复；PBS冲洗3次，然后滴加山羊血清，封闭10 min，去除封闭液，勿洗；直接滴加一抗工作液(1∶300稀释)，4 ℃孵育过夜。PBS冲洗，5分钟/次，共5次，随后滴加二抗工作液(1∶500稀释)，37 ℃恒温水浴锅中孵育90 min；PBS缓冲液冲洗，5 分钟/次，共计5次。滴加DAB显色液，室温孵育10 min，PBS缓冲液冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，二甲苯透明后封片。在数码显微镜下观察，随机选取5个视野，采用生物信号采集系统测定每个视野的平均光密度值，以5个视野的平均值作为该样本蛋白相对表达水平，进行统计分析。

1.3.4Western-blot法观察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗的表达 取适量耳蜗组织，剪碎，加入WB及IP细胞裂解液测定总蛋白浓度，计算上样。电泳后进行PVDF膜转印，水平摇床室温封闭1 h；滴加一抗(5% BSA封闭液1∶1 000稀释)，4 ℃冰箱中，孵育过夜。次日清晨从冰箱中取出PVDF膜，用TBST缓冲液洗涤5次，5分钟/次，滴加二抗(5% BSA封闭液1∶1 000稀释)，平置于37 ℃恒温水浴振荡器中，孵育2 h。洗涤后，打开凝胶成像分析系统中，将PVDF膜置于系统面板之上，充分滴加ECL发光液，与PVDF膜充分接触(A液：B液为1∶1)，曝光，采集图像，观测结果。

2 结果

2.1免疫组化方法检测AQP1、AQP2、AQP5蛋白在耳蜗的分布 两组豚鼠耳蜗组织中AQP1蛋白主要表达于螺旋韧带、螺旋神经节、前庭膜、Corti器、血管纹、螺旋板等处；AQP2蛋白主要表达于螺旋神经节细胞、Corti器、血管纹等处；AQP5蛋白主要表达于Corti器、螺旋神经节、内外螺旋沟、螺旋韧带等处(图2～4)。与空白组比较，模型组豚鼠耳蜗中AQP1、AQP2蛋白表达水平上调(P<0.01)，AQP5蛋白表达水平下调(P<0.05)，两组差异均有统计学意义(表1)。

图2 免疫组化方法观察豚鼠耳蜗组织中AQP1表达(×100)图3 免疫组化方法观察豚鼠耳蜗组织中AQP2表达(×100)图4 免疫组化方法观察豚鼠耳蜗组织中AQP5表达(×100)

表1 免疫组化方法观察各组豚鼠耳蜗组织中AQP1、AQP1、AQP5表达的平均光密度值

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2Western-blot法观察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗的表达 由表2及图5～7可见，模型组耳蜗中AQP1、AQP2蛋白表达含量较空白组明显提高(P<0.01)，AQP5较空白组明显降低(P<0.05)，差异均有统计学意义。

表2 Western-blot法观察各组豚鼠耳蜗组织中AQP1、AQP2、AQP5表达的平均光密度值

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

图5 Western-blot方法观察各组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达图6 Western-blot方法观察各组豚鼠耳蜗组织中AQP2表达图7 Western-blot方法观察各组豚鼠耳蜗组织中AQP5表达

3 讨论

AQPs作为水通道蛋白家族的成员，分布于人体多个器官及细胞，其对于水分子的跨膜转运起到了重要的作用，同时也对维持细胞稳定的结构起到了一定的作用。AQPs在全身都有分布，尤其是与水液代谢相关的器官，目前确定在内耳中有表达的水通道蛋白有AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7和AQP9[4，5]。本研究通过醋酸加压素建立豚鼠耳蜗膜迷路积水模型，选择AQP1、AQP2、AQP5三种具有代表性的水通道蛋白，观察这三种蛋白在内耳表达的具体位置及表达量，从而探讨其在豚鼠耳蜗膜迷路积水模型发生中可能的作用。

有研究报道AQP1主要分布于豚鼠耳蜗的基底膜、Corti器、内外螺旋沟、骨迷路、内淋巴管的纤维细胞、血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节、内淋巴囊、螺旋缘纤维细胞、椭圆囊壁、球囊壁等部位[3]。黄益灯等[6]发现在小鼠晕动病模型中，注入AQP1 RNA毒性的抑制剂后，小鼠内耳中AQP1表达量明显下降。有学者发现由腹腔注射醛固酮引起豚鼠膜迷路积水时，随着实验时间的延长，膜迷路积水的程度越来越重，AQP1的表达有所下调，而AQP2的表达相应上调[7]。本研究结果显示，AQP1蛋白主要分布于豚鼠耳蜗螺旋韧带、螺旋神经节、前庭膜、血管纹、Corti器、螺旋板等处，分布广泛且量大，且模型组AQP1表达较空白组上调，有显著差异(P<0.01)。本研究结果与上述研究结果有所差异，考虑可能不同种属实验动物之间AQP1的表达略有差异，另外，可能与不同研究所用的实验方法不同有关。

有报道称，AQP2蛋白主要表达在Corti器、血管纹、内淋巴囊以及螺旋神经节细胞中，而且在膜迷路积水的豚鼠内耳中AQP2的表达较正常豚鼠增加[3]。本实验结果显示，AQP2蛋白主要表达于螺旋神经节细胞、Corti器、血管纹等处；且模型组中AQP2表达量较空白组明显上调(P<0.01)，与上述研究结果一致；内耳中水的稳定通过AVP-AQP2系统进行的调节[8]，说明AQP2的表达上调与豚鼠体内注射醋酸去氨加压素有关，内耳中AQP2 mRNA的表达上调、V2R-cAMP-PKA-AQP2活化和内淋巴囊内AQP2的体内捕获与加压素产生增加和内淋巴吸收减少密切相关,这可能是导致内淋巴积水的原因[9，10]。

本研究结果显示，AQP5蛋白主要分布于Corti器、螺旋神经节、内外螺旋沟、螺旋韧带，与AQP1、AQP2蛋白相比表达较为局限；且模型组中AQP5蛋白表达较空白组下调，有显著性差异(P<0.05)。Hirt等[11]研究发现AQP5的表达局限于直接与内淋巴液体空间接触的外沟细胞, 因此, 推测AQP5可能在与梅尼埃病有关的内淋巴积水的形成中起作用。低频听力下降是梅尼埃的典型表现之一，Mhatre等[12]研究发现AQP仅在耳蜗顶回有表达，而非基底回，提示其表达变化与梅尼埃病的低频听力下降有关。

AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗膜迷路积水中分布各有差异，表达含量也有所不同，它们共同发挥协调作用，参与内淋巴积液的形成，但具体通过哪些方式及通路、各种蛋白发挥作用程度尚不明确，明确不同AQPs在内耳的分布有助于为梅尼埃病研究提供参考。