一例湖羊纤维素性肺炎的病理组织学观察

张 桦 魏 勇 王 利*

(1.西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，成都 610041； 2.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，成都 610041； 3.四川省畜牧科学研究院 兽医研究所，成都 610066)

湖羊为牛科绵羊属饲养动物，是我国一级保护地方畜禽品种。其为太湖平原重要的家畜之一，主要分布于浙江嘉兴和太湖地区。因具有成熟早、多胎、肉质好、毛皮珍贵、耐高温高湿等特点，在四川等地区广泛养殖[1]。羊链球菌病是由链球菌引起的一种急热性传染病，俗称“嗓喉病”、“大胆病”[2]。该病在羊群中传播速度快、致死率高，往往呈现地方性流行，分为最急性、急性、亚急性和慢性4 种类型[3-5]。链球菌是羊链球菌病的病原，也是一种人兽共患病致病菌，其所引起的猪链球菌病被我国农业农村部列为二类动物传染病[6]。绵羊和山羊感染链球菌可引起纤维素性肺炎等呼吸道疾病和全身性的败血症，主要症状为喉咙和下额淋巴结肿大、结膜充血、排出带有血液的粪便[3-5]。牛感染链球菌可致肺炎和乳腺炎，链球菌性肺炎临床症状可表现为呼吸急促，肺部存在摩擦音，有较多的分泌物从口鼻流出；乳腺炎表现在病牛乳房肿大，乳液分泌减少或停止[7-9]。链球菌病不仅对养殖业造成极大的危害和经济损失，还影响公共卫生安全，虽然国内已有不少相关研究，但仅局限于临床诊断和防控治疗，对具体病理学诊断极少。因此，为探明湖羊链球菌病的病理组织学，本研究拟以患病湖羊为研究对象，采用菌的分离鉴定、石蜡切片和动物回感试验等方法，以期探究感染羊的病理组织学和链球菌的致病性，为羊病防控提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病组织取自四川省某养殖场的病羊，在其濒临死亡时对其采取放血处死，并进行病理解剖。在无菌的条件下迅速采取肝、脾、肺等病变组织。

1.2 试验试剂及仪器

无水乙醇购自成都海兴化工试剂厂；二甲苯购自天津市致远化学试剂有限公司；多聚甲醛购自成都市科龙化工试剂厂；苏木素、醇溶伊红购自Biosharp公司。1.1×T3 Super PCR Mix购自北京天根生化科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；扩增16S rDNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

Leica RM2235S手轮转动式切片机、Leica BME光学显微镜购自德国徕卡微系统有限公司；凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司；WGZ-2XJ浊度计(细菌)购自上海昕瑞仪器仪表有限公司。

1.3 病羊临床观察

查看患病羊群的体温、身体状况、食欲和活动情况，记录临床症状。

1.4 病羊病理解剖观察

病羊静脉放血后立即处死，进行解剖和观察病变。用接种环蘸取其肺、肝等病变组织内部，划线于LB平板，保存于冰盒中。及时送回实验室进行细菌的分离纯化鉴定和菌种保存。取大小为5 mm×5 mm×2 mm的病变组织用生理盐水冲洗1～2 次，再保存于4%(V多聚甲醛∶V磷酸缓冲液=1∶25)多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L pH 7.4)中。病变组织进行拍照和分析记录。

1.5 病羊病理切片制作及观察

将已在4%多聚甲醛中固定24 h以上的病变组织取出，用流水缓慢冲洗24 h。依次放入不同比例的乙醇中脱水、二甲苯中透明、石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ中浸蜡1 h。将浸蜡好的组织包埋于包埋框中，包埋石蜡的温度应比浸蜡的温度略高。最后切片、贴片、烤片、H.E.染色、封片，自然风干后于Leica光学显微镜下观察病理特征。

1.6 细菌分离鉴定

将接种病变组织细菌的培养基放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。之后对平板里的菌按照常规操作进行分离和纯化后，从接种肺组织菌的LB平板里分离出1株菌，命名为Z-1，挑取单菌落接种于LB液体培养基，180 r/min下37 ℃震荡培养12 h，进行革兰氏染色、生理生化鉴定及16S rDNA基因鉴定。革兰氏染色鉴定按照《微生物学与免疫学实验教程》，生化鉴定按照《伯杰细菌鉴定手册》中细菌鉴定的方法，采用细菌生化微量鉴定管对菌株Z-1进行生化鉴定和结果判定。基因鉴定则是先对菌液进行细菌DNA提取、以16S rDNA通用引物(F2：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R2：CTACGG-CTACCTTGTTACGA)PCR扩增16S rDNA基因，并将扩增的PCR产物送去上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。反应体系为25 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，PCR条件为预变性98 ℃ 2 min、变性98 ℃ 10 s、退火55 ℃ 10 s、延伸72 ℃ 30 s、35个循环、72 ℃再延伸2 min。

1.7 动物回感试验

将10只体重为20 g左右健康状态良好的昆明小鼠，随机分成试验组和对照组。试验组5 只，对照组5 只。将上述纯化的Z-1菌于LB液体37 ℃培养12 h，用生理盐水稀释沉淀，制成细菌悬液。用细菌浊度计将菌液浓度调整至为5.876×108cfu/mL，试验组每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌悬液，对照组注射相同体积的生理盐水，试验周期为7 d。观察并记录小鼠的发病情况、身体状况、活动和死亡现象，对死亡的小鼠及时采取病理解剖和病原鉴定。

1.8 药敏试验

采用K-B纸片法对菌株Z-1进行药敏试验，将菌株Z-1接种50 mL的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养12 h。用WGZ-2XJ浊度计和无菌水将菌液浓度调整成0.5麦氏单位，取100 μL涂布于MH琼脂平板上，并将药敏纸片贴于其上，35 ℃培养18 h。用直尺测量抑菌圈长度，结果依据美国临床实验室标准委员会(CLSI/NCCLS)标准判定。药敏纸片有：氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、妥布霉素、阿米卡星、克林霉素、多西环素、氨卞西林、头孢哌酮、青霉素、拉氧头孢、头孢唑啉、头孢拉定、头孢噻肟、氨曲南、头孢克肟、利福平、痢特灵、氟苯尼考和卡那霉素。

2 结果与分析

2.1 病羊的临床症状

患病羊的发病特征为持续性咳嗽一周，并时常伴有喘气声，呼吸困难。口鼻周围时常会有黄色浓稠分泌物，体温上升到40 ℃。精神状况差，食欲差，运动减少。

2.2 病羊的解剖变化

对患病羊静脉放血处死后，观察各脏器，结果发现：肺组织充血水肿、肺叶增大，呈暗红色。将肺组织切成小块，流出多量血样泡沫状液体，将小块肺组织放于水中，可见其半漂浮于水面上(图1(a))；肝体积增大，被膜紧张，颜色呈暗紫色，切面有暗红色血液流出(图1(b))；肾脏肿大，颜色暗红，肾表面观察到大面积的树状充血，充血区域和周围组织分界明显。在肾皮质区还可见到灰黄色或者灰白色的化脓性小灶(图1(c))；肠管扩张，肠壁变薄，出血严重，表面可见红色黏液，切开肠腔，肠腔内充盈大量黄色的黏液，内容物混有血液(图1(d))。从这些症状初步推断为肺炎并发多器官组织感染。

(a)肺肿大，可见暗红色的肺小叶;(b)肝呈暗紫红色病变;(c)肾间质出血，扩张，有明显化脓小灶;(d)肠病变明显，可见鼓气，出血性黏液。
(a) The lungs are enlarged. Dark red lobules are seen. (b) The liver is dark purplish red. (c) Renal interstitial hemorrhage, dilatation, and small purulent lesions. (d) Intestinal lesions are obvious, with visible swelling and hemorrhagic mucus.
图1 湖羊病理剖解变化
Fig.1 Pathological and anatomical changes of Hu sheep

2.3 病羊的病理组织学变化

取病羊肺、肝、肾、肠、脾等组织制作病理切片，经H.E.染色，封片保存。观察可见，肺：细支气管壁增厚、充血、水肿，管腔中有浆液渗出、炎性细胞浸润和脱落的上皮细胞。肺泡壁毛细血管扩张、充血、出血，肺泡腔内充满了粉红色纤维素性渗出物和少量红细胞。组织中有大量的淋巴细胞和嗜中性粒细胞浸润(图2(a)、2(b))。肝：肝窦扩张充血，出现大量的红细胞，嗜中性粒细胞和灶性炎细胞浸润，肝索变细，排列紊乱(图2(c))。肾：肾小管上皮细胞肿胀、脱落，细胞核破碎、溶解。肾小球体积缩小，肾小囊腔增大。肾间质小血管和毛细血管扩张，充血、出血和少量淋巴细胞浸润。肾小管腔中可见淡粉红色的蛋白积液，即透明管型(图2(d))。肠：小肠腺体上皮细胞变性、坏死、脱落，可见少量嗜中性粒细胞，血管扩张充血，淋巴细胞浸润(图2(e))。脾：脾髓质部排列疏松，出现大量红细胞，淋巴细胞减少，含铁血黄素沉积(图2(f))。从病理组织学上进一步判断为纤维素性肺炎并伴有多组织炎症。

2.4 病羊肺组织的细菌鉴定

革兰氏染色结果显示，菌体呈球形，有的呈双球排列或单个存在，菌体边缘光滑，颜色为蓝紫色，为革兰氏阳性菌(图3(a))。菌株Z-1的生化结果显示：乳糖、麦芽糖、七叶苷、蔗糖、果糖、木糖、山梨醇、精氨酸水解均呈阳性反应；硝酸盐还原、尿素、木糖醇、甘露糖、甘露醇、覃塘、蜜二糖均呈阴性反应。该菌株生化结果与《伯杰细菌鉴定手册》中关于链球菌生化鉴定描述基本一致(表1)。分离菌的16S rDNA扩增结果显示，有 1 428 bp 目的条带出现(图3(b))，将测序结果经NCBI比对显示其与菌株NR_026471相似性最高，达到98%以上。革兰氏染色、生化和16S rDNA鉴定一致，综合判断该菌株为链球菌。

2.5 动物回感试验

腹腔注射菌液12 h后，试验组部分小鼠活动开始减弱，精神萎靡，食欲减退，背毛倒立杂乱。48 h时试验组开始出现第一只小鼠死亡，72 h后有2 只老鼠相继死亡，剩下2 只小鼠也陆续在第4天至第6天内死亡，在试验周期内正常组小鼠无异常。无菌条件下，解剖死亡小鼠发现肺、肝等均有明显肿胀和充血，肝表面散在分布出血点，这些病变与患病湖羊剖解变化一致。用无菌接种环穿刺肺、肝组织内部，划线于LB培养基，24 h培养后挑取单菌落于LB液体培养，经鉴定为链球菌，与病羊中分离出的菌种一致。

2.6 药敏试验

K-B药敏纸片法结果显示：菌株Z-1对氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、妥布霉素、阿米卡星、多西环素等敏感；对氨苄西林、青霉素、拉氧头孢、头孢唑林、头孢噻肟、氨曲南等耐药；对克林霉素、头孢哌酮较敏感(表2)。

3 讨论与结论

羊纤维素性肺炎可由传染性因素或非传染性因素引起，主要以细支气管和肺泡内填充大量纤维性渗出物为特征，是一种引起持续性高温的急性肺炎[10]，此型肺炎常侵犯一侧肺或全肺，通常又称之为大叶性肺炎。Besser等[11]报道大角羊肺炎会引起细支气管中浆液渗出和上皮细胞脱落，这与该患病羊肺细支气管中填充大量浆液，肺毛细血管扩张、充血，炎性物质渗出病理变化基本一致。但与Lindstrom等[12]对瑞典羔羊支气管肺炎的病理变化和细菌学报道有所区别，该研究中除了充血、炎性物质渗出这些基本病理变化外，还伴随有透明疤痕，支气管上皮增生以及脓性灶的出现。这可能与其肺组织病变严重，并且由肺炎链球菌、溶血性链球菌、支原体等混合感染有关。

引起纤维素性肺炎的病原菌较多，常见的有支原体、链球菌、嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌等，多经呼吸道感染，然后迅速沿支气管树扩散。试验中引起纤维素性肺炎的分离菌株Z-1经鉴定为链球菌，为无宿主专嗜性革兰氏阳性菌，菌体呈双球型呈链状排列，也有单个存在，属需氧或兼性厌氧菌[13]。受该菌感染的动物主要引起呼吸道疾病，继而还可以引发败血症、脑膜炎、心内膜炎等多种疾病[14]，其中羔羊和母羊的感染率高于其他年龄阶段的羊，并且绵羊易感于山羊。钱一相等[15]在山羊链球菌病诊治和李辉[16]对羊链球菌病的病理组织学均与本病例中湖羊感染链球菌的情况相似，肺泡壁水肿、充血，肺上皮细胞脱落，肺泡中充满红细胞，有纤维素性渗出物，有中性白细胞的浸润。剖解中观察到脑组织轻微水肿，血管扩张充血，病理组织学观察到血管中有大量红细胞出现，这与陈申申等[17]在对致仔猪脑膜炎猪链球菌的分离鉴定报道中情况一致。与Eroksuz等[18]在鲍曼不动杆菌引起2岁母羊脑脓肿和支气管肺炎的研究中有所差异， 在化脓性的脑炎，脑脓肿以及在脑切片中发现了微生物团块。

(a)、(b)肺可见充血、水肿、粉红色纤维素，大量炎症细胞浸润;(c)肝窦扩张充血，肝索排列紊乱;(d)肾小球萎缩，上皮细胞肿胀，脱落;(e)小肠腺细胞变性、坏死，血管扩张充血，淋巴细胞浸润;(f)脾组织排列疏松，含铁血黄素沉积。每一个图中的小方框图，为局部扩大图。
(a) and (b): Hyperemia, edema and pink cellulose can be seen in the lungs, with numerous inflammatory cells infiltrating. (c) Dilatation and congestion of hepatic sinus, disordered arrangement of hepatic cords. (d) Glomerular atrophy, epithelial cell swelling, shedding. (e) Denaturation and necrosis of small intestinal adenocytes, vascular dilatation and congestion, lymphocyte infiltration. (f) Loose arrangement of spleen with hemosiderin deposition. The small square graph in each graph is local enlarged image.
图2 湖羊病变组织的病理切片(H.E.染色400×)
Fig.2 Pathological section of diseased tissues of Hu Sheep (H.E. staining 400×)

(a) 革兰氏染色结果; M: DL-2000 DNA marker; 1: Z-1菌株; (b) 16S rDNA鉴定结果
(a) Gram staining results; M: DL-2000 DNA marker; 1: Z - 1 strain; (b) 16S rDNA identification results
图3 Z-1菌株鉴定结果
Fig.3 Identification results of z-1 strain

表1 菌株Z-1的生化试验结果
Table 1 Biochemical results of strain Z-1

项目Item结果Result项目Item结果Result硝酸盐还原 Nitrate reduction-木糖 Xylose+乳糖 Lactose+甘露糖 Mannose-尿素 UREA-山梨醇 Sorbitol+麦芽糖 Malt sugar+甘露醇 Mannital-七叶苷 Aesculin+精氨酸水解 Arginine hydrolysis+蔗糖 Sucrose+覃糖 Tain sugar-木糖醇 Newtol-蜜二糖 Melibiose-果糖 Fructose+

注：+ 为阳性； -为阴性。

Note：+, positive； -,negative.

表2 菌株Z-1药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of strain Z-1

表2(续)

综上所述，本研究依据临床症状、现场解剖观察、切片分析以及对患病羊细菌分离纯化鉴定，分析该病羊可能是由于冬春季节天气寒冷，造成抵抗力下降，感染链球菌诱发的纤维素性肺炎，进而导致急性发病、死亡。羊链球菌病是一种急性，热性传染病。在日常的养殖中，特别是集约化养殖时，要注意羊场通风，饲养管理科学化、合理化，加强卫生管理，粪便经常清理，养殖密度不应过大。本病例鉴定的详细报告为羊链球菌病的诊断与防控提供参考价值。