响应面法优化乌骨藤中白桦脂酸提取工艺

石 玲，王泽锋，张 薇，闵 勇

(红河学院理学院，云南 蒙自 661199)

乌骨藤，又名通关藤，系萝藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜属植物通关藤(Marsdenia tenacissima)的藤茎。主要产于云南、贵州、广西等地。药用叶、藤，全年可采，其味苦、微寒，具有清热解毒、止咳平喘、消炎镇痛等功效，可用于治疗肺炎、咳喘等。乌骨藤的主要化学成分为甾体皂苷、多糖、萜类化合物等[1]。现代药理学研究表明，乌骨藤具有调节免疫功能和抗肿瘤作用[2—3]，以乌骨藤提取物制备而成的中药消癌平对肺癌、肝癌等肿瘤具有明显的抑制作用[4—5]，是一种有发展前景的抗癌中药。近年来，从中药材中提取抗肿瘤有效成分越来越受到关注。全世界已从多种中药材中筛选出近万种有效成分，推出了数十种抗肿瘤药物。

白桦脂酸属五环三萜类有机酸，存在于多种中药材中，除有抗炎抑菌、降血脂及抗疟疾等活性外，对黑素瘤、神经外胚层及恶性脑肿瘤等多种肿瘤细胞有强烈的毒杀效应，而对正常细胞无杀伤力，同时其抗 HIV-1病毒活性强于部分现有临床应用药物[6—9]，是治疗艾滋病、肿瘤的新物质。现有提取分离白桦脂酸的方法多以二氯甲烷为提取溶剂，该方法不适于白桦脂酸的工业生产，限制了白桦脂酸的开发和利用。本研究建立了适合于乌骨藤中白桦脂酸的超声提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白桦脂酸对照品(批号：MUST-13010404)，购自北京世纪奥科生物技术有限公司；乌骨藤于2013年12月采自云南省红河州屏边县，经云南省红河学院闵勇教授鉴定为萝藦科植物通关藤的藤茎；乙腈为色谱纯，其余化学试剂均为国产分析纯。

岛津超高效液相色谱仪 LC-30A：LC-30AD×2输液泵；DGU-20A5在线脱气机；SIL-30AC自动进样器；CTO-30AC柱温箱；CBM-20A系统控制器；LabSolution Ver.5.41色谱工作站；超声波清洗器(SK5200HP，上海科导超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(HH-S24，金坛市大地自动化仪器厂)；电子天平(CP224C，奥豪斯仪器(上海)有限公司)；化学分析滤纸；有机相滤膜。

1.2 色谱柱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS柱(150×2.0 mm I.D，2.2 µm)；流动相：乙腈-水(80:20)；检测波长：210 nm；流速：0.35 mL·min-1；柱温 35 ℃；进样量：5 μL。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备

精密称取适量白桦脂酸对照品，加甲醇溶解后配成0.70 mg·mL-1溶液，备用。

1.3.2 标准曲线绘制

分别精密吸取 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mL浓度为0.70 mg·mL-1白桦脂酸对照品溶液，用甲醇定容至25 mL配成标准储备液。以甲醇溶液为空白，按上述色谱柱条件进行测定，以白桦脂酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 白桦脂酸提取

精密称取0.50 g乌骨藤粉末，按一定的提取条件(超声功率、提取时间、提取溶剂浓度、料液比和提取次数)进行超声提取，过滤，收集滤液，回收溶剂至近干，用适量甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中定容，即得供试品溶液。

1.3.4 乌骨藤白桦脂酸含量测定

分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定。

1.4 实验设计

1.4.1 单因素实验

1.4.1.1 超声功率

按照 1.3.3方法，固定乙醇浓度 50%，料液比(g/mL，下同) 1:10，提取时间5 min，以不同超声功率(100、120、140、160、180 W)依次进行超声提取，考察超声功率对白桦脂酸提取率的影响。

1.4.1.2 提取时间

按照 1.3.3方法，固定乙醇浓度 50%，料液比1:10，超声功率140 W，设置不同提取时间(5、10、15、20、25 min)，考察其对白桦脂酸提取率的影响。

1.4.1.3 乙醇浓度

按照1.3.3方法，固定料液比为1:10，超声功率140 W，提取时间20 min，依次改变乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)，考察乙醇浓度对白桦脂酸提取率的影响。

1.4.1.4 料液比

按照1.3.3方法，固定乙醇浓度80%，超声功率140 W，提取时间20 min，改变料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)，考察其对白桦脂酸提取率的影响。

1.4.1.5 提取次数

按照1.3.3方法，固定乙醇浓度80%，超声功率140 W，提取时间20 min，料液比为1:25，分别超声提取1、2、3、4、5次，考察提取次数对白桦脂酸提取率的影响。

1.4.2 响应曲面实验设计

在单因素实验基础上，以80%乙醇为提取溶剂，选择超声功率(A)、提取时间(B)、料液比(C)和提取次数(D)作为响应面设计的四个因素，利用 Design Expert 8.06软件的中心组合试验Box-Behnken分析优化乌骨藤中白桦脂酸的提取条件。每个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码，以白桦脂酸提取率为响应值(Y)，进行四因素三水平响应曲面分析实验[10—11]。因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken设计因素及水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnke design

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以白桦脂酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到白桦脂酸的回归方程为：Y=1.213×106X+651.43，r=0.9996。结果表明，白桦脂酸在0.028～0.560 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2 单因素对白桦脂酸提取效果的影响

2.2.1 超声功率

从图1: A可知，随着超声功率的增大，白桦脂酸提取率先增大后稍微降低，在140 W时提取率最高。这是当功率增加时超声产生空化作用有利于白桦脂酸溶出，但功率过大时，因空化作用过强而产生大量气泡增加散射衰减形成空化屏障，且容器内发生局部瞬时升温，削弱超声提取效果，从而降低白桦脂酸提取率[12]。因此，超声功率140 W为最佳。

2.2.2 提取时间

图1: B显示，随着提取时间的增加，白桦脂酸提取率先逐渐增大后趋于不变。其原因可能是随着提取时间的延长，乌骨藤中的白桦脂酸几乎全部溶出，再增加提取时间提取率没有提高，且增加成本，故提取时间20 min为最佳。

2.2.3 乙醇浓度

由图1: C可知，随着乙醇浓度的增加，白桦脂酸提取率呈先升后降的趋势。当乙醇浓度为80%时，乌骨藤中的白桦脂酸提取率最高，乙醇浓度再增大时提取率开始降低。这是由于乙醇浓度不同导致浸提溶剂极性大小不同，因此对白桦脂酸的溶出效果有一定影响，同时，这可能也与乌骨藤中所含白桦脂酸化合物的性质有关[13]。因此，适宜乌骨藤白桦脂酸提取的乙醇浓度为80%。

图1 单因素对白桦脂酸提取率的影响Fig. 1 Effects of single factor on the extraction rate of betulinic acid

2.2.4 料液比

料液比对白桦脂酸提取率的影响如图1: D所示。随着料液比不断增大，白桦脂酸提取率逐渐增加，当料液比增至1：25时，白桦脂酸提取率已基本达到最大值，继续增加料液比白桦脂酸提取率变化不大。随着提取溶剂的增加，乌骨藤与溶剂的接触面积增大，从而有利于白桦脂酸溶出，当料液比增加到一定程度时，白桦脂酸已经基本提取完全。因此，适宜提取的料液比为1:25。

2.2.5 提取次数

由图1: E可知，随着提取次数的增加，提取率也随之增加，但提取两次以后，提取率升高不明显。说明提取两次后乌骨藤的白桦脂酸已基本被提尽，再增加提取次数会浪费溶剂用量及增大蒸发浓缩负荷，所以选择提取次数为2次。

2.3 响应曲面分析优化工艺

2.3.1 白桦脂酸提取率拟合回归模型建立

采用 Design Expert 8.06软件的中心组合试验Box-Behnken进行实验设计考察，以白桦脂酸提取率为响应值，结果见表2。

表2 Box-Benhnken试验方案及其提取率Table 2 Box-Behnken design with experimental results

采用响应曲面法分析实验结果，对实验数据进行二次多项式回归拟合，得到回归方程如下：

其中，Y为白桦脂酸提取率；A为超声功率；B为提取时间；C为料液比；D为提取次数

2.3.2 方差显著性分析

应用回归分析对方程各个因子进行方差分析。由表3可知，以白桦脂酸提取率为响应值，回归方程的显著性P<0.0001，说明该二次方程模拟极显著，回归方程模型与实验拟合性较好，实验误差较小，可用于乌骨藤白桦脂酸提取率的分析和预测[14—15]。模型决定系数R2=0.9880，说明响应值(白桦脂酸提取率)的变化有98.80%来源于所选变量，即超声功率、提取时间、料液比、提取次数。回归方程中各个变量对响应值影响的显著性由F检验判断，P值越小，则变量影响越显著。A、C、D、AB、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2对白桦脂酸提取率有极显著影响，AD对白桦脂酸提取率有显著影响(表3)。

2.3.3 乌骨藤中白桦脂酸提取工艺的响应面分析

影响乌骨藤中白桦脂酸提取率的四个因素(超声功率、提取时间、料液比和提取次数)之间交互作用的效果如图 2所示，6个响应曲面的投影等高线最小椭圆的中心均落在所选的范围内，响应值(乌骨藤白桦脂酸提取率)在4个因子设计的范围内呈现极大值。由图2: a可知，乌骨藤白桦脂酸提取率随超声功率的增大以及提取时间的延长而增大，到达两因素的最佳编码值出现最大值。由图2: b可知，白桦脂酸提取率随超声功率和料液比的变化而变化，超声功率增加，提取率先增大后趋于平缓。由图2: c可知，提取率随超声功率和提取次数的变化而变化，超声功率增大，提取率先增加后减小，且变化幅度较大，提取率随提取次数增大至最大值后减小，但变化幅度不大。由图2: d～f可知，提取时间与料液比、提取时间与提取次数、料液比与提取次数之间的交互作用显著，表现为曲面较陡[16]。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the quadratic polynomial model

图 2 提取时间、超声功率、料液比、提取次数对白桦脂酸提取率影响的响应面图Fig. 2 Response surface plots of the effect of extraction time, ultrasonic power, liquid-material ratio, times of extraction on the yield of betulinic acid

2.4 最佳提取条件

采用Design Expert 8.06软件进行分析，得到乌骨藤中白桦脂酸的最佳提取工艺为：超声功率150.30 W，提取时间19.69 min，料液比1:25.61，提取2.32次，其白桦脂酸提取率为0.314%。为了验证响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件提取白桦脂酸，考虑到实际操作的便利，将提取工艺调整为：超声功率150 W，提取时间20 min，料液比为1:25，提取2次。采用高效液相色谱法对乌骨藤中白桦脂酸含量进行测定，图3: A为白桦脂酸标准品的高效液相色谱图，图3: B为白桦脂酸提取液的高效液相色谱图，得到的白桦脂酸提取率为0.311%，其相对误差小于1%，该工艺合理可行。

图 3 白桦脂酸高效液相色谱图Fig. 3 High performance liquid chromatography of betulinic acid

3 结论

本研究以乙醇为提取溶剂，提取乌骨藤中的白桦脂酸。首先进行单因素实验，分别考察了超声功率、提取时间、乙醇浓度、料液比及提取次数对白桦脂酸提取率的影响。在单因素实验基础上，通过Design Expert 8.06软件中的Box-Behnken中心组合设计进行四因素(超声功率、提取时间、料液比和提取次数)三水平响应曲面实验，并对实验数据进行分析优化，从而得到白桦脂酸的最佳提取工艺。结果显示，乌骨藤中白桦脂酸以80%乙醇为提取溶剂的最佳提取工艺为：超声功率150 W，提取时间20 min，料液比为1:25，提取2次。在此条件下，白桦脂酸提取率为0.311%。因此，利用响应面分析方法对乌骨藤中白桦脂酸超声提取工艺进行优化合理可行，可获得最优的工艺参数，能有效减少工艺操作的盲目性，从而为乌骨藤中白桦脂酸进一步的开发利用奠定基础。