紫娟茶提取物作果脯天然着色剂的应用研究

刘明丽，蒋宾，张正艳，石兴云，刘倩葶，焦文文，王兴华，郑文中，王力川，马燕，赵明，*

（1.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南昆明650201；2.云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室，云南昆明650201；3.云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南昆明650201；4.普洱市茶叶科学研究所，云南普洱665000；5.普洱南药庄园科技有限公司，云南普洱665000）

花青素（anthocyanin）又称为花色素、花色苷，是一类广泛存在于蓝莓、黑枸杞、紫甘蓝等植物中的水溶性天然色素[1]。研究发现，花青素具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗肿瘤和抗癌等作用，在食品、保健品、化妆品和医药等领域具有广泛的应用前景[2-5]，另外，作为一种天然色素，花青素具有作为食品着色剂的应用潜力。而着色剂是食品添加剂中的一大类分支，根据来源可分为动物色素、植物色素和微生物色素，在食品加工和生产中有着广泛的应用[6-7]。例如，Diaz等[8]研究证实从植物中提取出来的原花青素是天然的食品染色剂，来源广且安全，既可以丰富口感，又具有一定的营养价值；FU等[9]研究发现高粱生物着色剂可以广泛应用于食品发酵。因此，花青素作为食品着色剂，可在食品工业等众多领域进行应用，并且前景较为广泛。

紫娟茶（Camellia sinensis var.assamica Cultivar Zhijuan）是一种稀有茶树品种，具有紫茎、紫叶、紫芽的特点，其新梢中的花青素含量高达29.14 mg/g[10-11]。陈保等[12]采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用分析香气挥发成分，从不同加工工艺的紫娟茶样中共检出146种香气化合物；Wang等[13]利用等压标记法在紫娟茶叶片中鉴定出815种不同蛋白，其中20种与花青素代谢的调节有关；Tan等[14]采用高效液相色谱法和液相色谱-质谱法对8种紫娟茶花青素进行了鉴定，结果表明以花青素-3-O-半乳糖苷含量最高，并通过抗氧化活性测定，表明紫娟茶总花青素与抗氧化活性呈显著正相关；梁名志等[15]通过单因素和正交试验得到最佳醇提工艺条件是：70%乙醇溶剂、回流提取30 min、回流温度80℃、料液比1∶10；而FEI等[16]采用响应面法对提取工艺进行了研究，得到的提取条件为反应温度29℃，反应时间132 min，酸性甲醇料液比1∶26。由此可见紫娟富含花青素，并且是其重要的活性物质，但是关于紫娟茶花青素的应用研究还较少。

佛手是芸香科植物佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）的果实，其花、叶和果实均可入药，具有理气、行气、止呕、健脾、化啖等功效[17]。新鲜的佛手外皮鲜黄，果肉白色，果实气味芳香浓郁，其含有的苷类、黄酮等活性物质具有很好的药理作用[18]。佛手是首批列为药食同源的食品，以佛手研究开发的食品主要有饮料、酒、果脯和茶等[19-20]。佛手果脯是以佛手为材料，通过浸糖等工艺加工而成的果脯类嚼劲；组织形态饱满、伸直不卷曲、有韧性[21]。

富含花青素的紫娟茶具有作为天然食品着色剂的潜力，因此对此开展研究，开发了一种色泽紫红、有茶味且低糖的佛手果脯，以期丰富佛手果脯产品类别，拓展紫娟茶的应用，提升紫娟茶的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜佛手、白砂糖：市售；紫娟晒青茶：由普洱市茶叶科学研究所加工；氯化钙、食品级柠檬酸：北京鑫达食品添加剂有限公司；盐酸、浓硫酸、蒽酮为国产分析纯试剂；乙腈（色谱纯）：Sigma公司；飞燕草色素（delphindin）、矢车菊色素（cyanidin）、牵牛花色素（petunidin）、天竺葵色素（pelargonidin）、芍药色素（peonidin）、锦葵色素（malvidin）对照品：上海惠城生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CP214型电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-S28S数显恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司；101A-2型电热鼓风恒温干燥箱：上海市崇明实验仪器厂；756 CRT紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

佛手柑→去皮、洗净、切条→烫漂与硬化→浸糖与护色→干燥及储藏。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 佛手切条

挑选新鲜、表皮光滑的佛手，洗净晾干，去外皮，去边角、软烂和病虫害部分，并切成厚0.5 cm～0.7 cm、长5 cm的条状。

1.3.2.2 烫漂与硬化

佛手条蒸5 min，迅速用冷水冷却，捞出沥水；加入0.2%氯化钙水溶液，浸泡2 h做硬化处理，清水洗净沥干。

1.3.2.3 浸糖、着色和干燥

加1倍体积的水浸煮10 min后，置于15%的蔗糖水溶液中静置43 h，捞出清水冲洗沥干；按1∶1（g/mL）加入含0.2%柠檬酸的紫娟茶沸水提取液浸煮30 min后静置40 h，60℃干燥18 h。成品加入干燥剂放于干燥阴凉处即可。

1.4 试验方案

1.4.1 单因素试验

取适当的佛手果脯，参照郭晓强等[21]传统果脯加工工艺，以浸糖时间48 h，设置浸糖浓度为5%、10%、15%、20%，60℃干燥18 h制作佛手果脯；以浸糖浓度15%，设置浸糖时间为24、48、72 h，60℃干燥18 h制作佛手果脯；以15%的浸糖浓度浸糖48 h，设置干燥温度为50、60、70、80℃，干燥18 h制作佛手果脯；以15%的浸糖浓度浸糖48 h，设置干燥时间为15、18、21 h，60℃干燥制作佛手果脯；分别考察浸糖浓度、浸糖时间、干燥温度、干燥时间对佛手果脯品质的影响。

1.4.2 正交试验

根据各单因素试验所得结果，选取浸糖浓度（12%、15%、18%）、浸糖时间（43、48、53 h）、干燥温度（55、60、65℃）、干燥时间（16、18、20 h），以佛手果脯的色泽、外观、口感、气味作为感官审评研究指标，设计正交试验。

1.4.3 紫娟茶的添加量试验

将紫娟茶按1∶50（g/mL）加入到冷水中进行提取，加热至沸腾即可。然后加入护色剂柠檬酸，在基于正交试验优化的工艺条件下，在第2次浸煮时，根据果脯量按1∶1（g/mL）分别加入浓度为2%、3%、4%的紫娟茶沸水提取液，考察紫娟茶添加量对佛手果脯品质的影响。

1.4.4 果脯的质量要求及评分标准

参照徐莉珍等[22]果脯的感官审评标准，对佛手果脯和紫娟佛手果脯的色泽、外观、口感、气味进行审评，各评价指标见表1。

表1 佛手果脯的感官审评标准Table 1 Standard for sensory evaluation of preserved fruit of bergamot

1.4.5 理化指标测定

参照绿色食品蜜饯理化检验国家标准GB 8956-2016《食品安全国家标准蜜饯生产卫生规范》[23]测定果脯含水量；参照姚立虎等[24]蒽酮比色法和陈虎等[25]分光光度法测定总糖及紫娟茶佛手果脯的花青素总含量。应用课题组建立的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定花青素的单体成分含量，主要方法如下：

样品制备：称取0.2 g茶叶磨碎样品，加甲醇8 mL，盐酸0.8 mL，置于圆底烧瓶水浴回流90 min（85℃，避光），过滤于10mL容量瓶，用少许甲醇洗涤残渣并转入容量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 μm过滤膜过滤，待测。

检测：流动相A为0.261%磷酸，5%乙腈；流动相B为80%甲醇；洗脱梯度程序：0～25 min B液从35%线性梯度增加至60%；25 min～25.5 min，B液从60%线性梯度增加至100%；25.5 min～29.5 min，B液100%保持不变；29.5 min～29.9 min，B液由100%线性梯度降低至35%B；30 min程序停止；以10%B液后运行平衡6 min；流速为1.0 mL/min。柱温为40℃，检测波长530 nm。

1.4.6 数据分析

应用软件SPSS 22.0进行统计分析和数据处理，6人参与感官审评，理化指标测定每个处理重复3次，每个测定重复2次，以平均值±标准差（mean±SD）表示平均值。

2 结果与分析

2.1 紫娟晒青茶中的花青素单体成分含量

紫娟茶花青素测定的HPLC色谱图见图1。

图1 紫娟茶花青素测定的HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram for determination of anthocyanin in Zijuan tea

按建立的方法提取紫娟茶花青素，HPLC检测（图1），从样品中检测到6个花青素单体，包括飞燕草色素、矢车菊色素、牵牛花色素、天竺葵色素、芍药色素和锦葵色素。紫娟晒青茶中的花青素单体成分含量见表2。

表2 紫娟晒青茶中的花青素单体成分含量Table 2 Contents of anthocyanin in Zijuan Sun-dried tea

由表2可知，其中以飞燕草色素含量最高，达1.98 mg/g。解东超等[26]研究发现紫娟茶飞燕草-3-O-半乳糖苷含量较高。本研究发现飞燕草色素含量较高，是因为提取时飞燕草-3-O-半乳糖苷经过酸水解形成飞燕草色素所致。

2.2 单因素试验

2.2.1 浸糖和干燥条件对佛手果脯品质的影响

单因素试验果脯的感官审评得分见图2。

图2 单因素试验果脯的感官审评得分Fig.2 Sensory evaluation scores of preserved fruit of bergamot in single factor test

设置5%、10%、15%、20%的浸糖浓度浸糖佛手48 h，60℃、干燥18 h制作佛手果脯并进行感官审评，综合得分见图2A。结果表明浸糖浓度为5%和10%的果脯得分显著低于 15%、20%（p＜0.05），15%和20%的浸糖浓度得分差异不显著，但考虑到经济效益和果脯含糖量，浸糖浓度选择15%为宜。

以15%的浸糖浓度，设置浸糖时间24、48、72 h，60℃、干燥18 h制作佛手果脯并进行感官审评，综合得分见图2B。结果表明浸糖时间为48 h和72h加工的佛手果脯得分无显著差异（p＞0.05），但显著高于24 h（p＜0.05）。浸糖时间大于48 h后得分差异不显著，原因可能是浸糖48 h后，根据渗透平衡，佛手含糖浓度已达饱和状态，所以浸提时间以48 h左右为宜。

以15%的浸糖浓度浸糖佛手48 h，60℃干燥15、18、21 h，进一步优化佛手果脯的最佳干燥时间，感官审评综合得分见图2C。由图可知在15 h～21 h干燥时间范围内，果脯得分呈先增后减的趋势，18 h干燥得分显著高于其他（p＜0.05），且以21 h的品质最差，原因可能是在长时间的干燥过程中，果脯中的有关成分在高温条件下会发生变化，大量的芳香物质和内含成分会随水分的蒸发带走，造成香气等的损失，所以干燥时间以18 h左右为宜。

在15%的浸糖浓度浸糖佛手48 h和干燥时间为18 h基础上，设置干燥温度50、60、70℃、80℃制作佛手果脯，感官审评综合得分见图2D。结果表明60℃干燥得分显著高于其他（p＜0.05），当高于60℃后得分呈直线下降趋势，原因可能是温度高导致失水过快，外观皱缩，果脯较硬，所以果脯的干燥温度设定为60℃为宜。

2.3 正交试验

在单因素试验基础上，进一步采用正交设计优化工艺，正交设计与试验结果见表3。

表3 佛手果脯加工工艺的正交设计与试验结果Table 3 Design and results of of orthogonal experiment for processing of preserved fruit of bergamot

从表3中可以看出：生产试验的4个因素对佛手果脯品质有着不同的影响，表现为：浸糖浓度＞干燥时间＞浸糖时间＞干燥温度；最佳工艺条件为A2B3C2D1即浸糖时间53 h、浸糖浓度15%、干燥温度55℃、干燥时间18 h。通过进一步对比试验A2B3C2D1组合感官审评优于总分最高组合A2B1C2D2，可确定最佳工艺条件为A2B3C2D1，即浸糖时间53 h、浸糖浓度15%、干燥温度55℃、干燥时间18 h。

2.4 紫娟茶添加量对佛手果脯品质的影响

基于正交优化的工艺条件，考察着色所用的紫娟茶添加量对果脯品质的影响。按1∶1（g/mL）加入含0.2%柠檬酸的紫娟茶沸水提取液浸煮30 min后静置40 h，对制作的紫娟佛手果脯进行感官审评，综合得分见图3。

图3 不同添加量紫娟茶加工佛手果脯感官审评得分Fig.3 Sensory evaluation score of preserved fruit of bergamot processed with different level of Zijuan tea

由图3表明，2%的紫娟茶添加量果脯品质较3%和4%好，原因可能是由于添加3%和4%的紫娟茶提取液颜色较深，所制作的紫娟佛手果脯色泽为深紫红色，造成色泽得分低（p＜0.05），所以紫娟茶的最适添加量为2%。

2.5 佛手果脯的感官审评和理化指标

佛手果脯是药食同源的食品，目前有郭晓强等[21]、徐莉珍等[22]和谌国莲等[27]研制成的佛手果脯含糖量分别为38.6%、38.2%和75%。而本文对浸糖浓度等工艺进行优化，制作成的紫娟佛手果脯和常规佛手果脯含糖量分别为30.58%和33.53%，低于前人研究结果。理化测定结果表明本研究加工所得且两种类型的佛手果脯含水量和含糖量均符合国家标准，同时与候兰等[28]研究得出的低糖果脯指标含水率和含糖量分别在35%和55%以下相符。

吕海鹏[29]用高效液相对紫娟茶中花青素组分进行了分析，表明紫娟茶中的色素种类多、含量高。沈晓佳等[30]研究结果表明紫娟茶提取物物对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性均有较好的抑制作用，特别是含有花青素和茶多酚混合物，这些提取物通过抑制酪氨酸酶的活性可以预防和治疗老年斑、黄褐斑等色素沉着性疾病等。由此可见，紫娟茶花青素具有良好的着色性和生理活性。本文采用富含花青素的紫娟茶作为天然着色剂，与常规佛手果脯相比，紫娟果脯呈紫红色、半透明、韧性好、伸直不卷曲、有嚼劲；口感及风味表现为酸甜适中，茶香显，无异味。

常规佛手果脯和紫娟茶佛手果脯产品照片见图4，佛手果脯含水量、总糖和花青素含量见表4。

从表4中可知，紫娟茶佛手果脯的花青素总含量是明显高于佛手果脯（p＜0.05）。应用富含花青素的紫娟茶作为天然食品着色剂，有望扩大食品工业的应用，因为它不仅绿色健康提高食品的色泽及感官特性，也可以更好地满足人们对食品品质更高的需求。

图4 常规佛手果脯和紫娟茶佛手果脯产品照片Fig.4 Photograph of normal preserved fruit of bergamot and preserved fruit of bergamot of Zijuan tea

表4 佛手果脯含水量、总糖和花青素含量Table 4 Water content，total sugar and anthocyanin content of preserved fruit of bergamot

3 结论

通过单因素和正交试验优化，本研究建立一种紫娟茶佛手果脯食品加工工艺：浸糖浓度15%、浸糖时间43 h、干燥温度60℃、干燥时间18 h、紫娟茶添加量2%，加工的紫娟茶佛手果脯为紫红色、半透明、韧性好、酸甜适中、有茶味，经测定其含糖量为30.58%，含水量为17.06%，花青素总含量为1.006 mg/g。本研究不仅为加工低糖茶味佛手果脯提供试验基础，而且也提供了紫娟茶作为一种食品天然着色剂应用案例。