澳洲坚果叶片酚类物质提取及抗氧化活性研究

张明，帅希祥，马飞跃，杜丽清

（中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，农业部热带果树生物学重点实验室，广东湛江524091）

澳洲坚果（Macadamia tetraphylla L.），又称夏威夷果、昆士兰果等，是一种原产于澳大利亚东部亚热带雨林的山龙眼科澳洲坚果属多年生常绿果树[1]。1979年，我国开始引进商业性品种并进行环境适应性试验[2]。经过近40年的研究与发展，我国澳洲坚果种植面积已超越澳大利亚和南非，成为种植面积最大的国家[3]，相关研究也日益增多。

当前，国内外对澳洲坚果的研究主要集中于种植技术、病虫害防治，果仁油脂加工及副产物的综合利用等[4-9]，对澳洲坚果叶片的报道相对较少。R.A.Step-henson等[10]研究了气候、品种、土壤和叶片营养状况等对澳洲坚果产量的影响。Stephen Wesley Herbert等[11]对昆士兰东南部澳洲坚果叶片中氮、钾、磷、钙、硼等的营养水平季节性模式进行研究。已有研究表明，植物叶片中含有丰富的酚类等活性成分，如芒果、番石榴等[12-13]。朱泽燕等[14]采用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 对澳洲坚果幼叶挥发性成分进行鉴定，其中，共鉴定出对羟基苯甲醛、3，5-二叔丁级-4-羟基苯甲醛2种酚类挥发性成分，但并未对其提取工艺条件进行系统优化。因此，本研究以总酚提取量为考察指标，从提取溶剂种类、料液比、溶剂浓度、提取温度和提取时间5个方面对提取工艺进行优化；同时，对澳洲坚果叶片总酚的体外抗氧化活性进行评价，以期为澳洲坚果叶片的综合利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

澳洲坚果叶片：由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃提供，品名为南亚1号。新鲜澳洲坚果叶片经粉碎后保存于-20℃冰箱备用。

1.2 试剂与设备

没食子酸（＞99%）：阿拉丁化学试剂有限公司；水溶性维生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）：sigma公司；福林酚、碳酸钠、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）：碧云天生物技术有限公司。

CP214分析天平：奥康斯仪器有限公司；ST40高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技（中国有限公司）；BCD-539WT冰箱：青岛海尔股份有限公司；VB-250A高速多功能粉碎机：浙江永康市速峰工贸有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州杜甫仪器厂；Spark 10M酶联免疫分析仪：瑞士TECAN公司。

1.3 试验方法

1.3.1 澳洲坚果叶片酚类物质提取方法

取一定量粉碎后的澳洲坚果叶片置于三角瓶，按试验设定的料液比加入一定浓度提取溶剂，在设定的提取温度、提取时间条件下进行提取。提取结束后，于8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液保存于4℃冰箱备用。

1.3.2 单因素试验设计

1.3.2.1 提取溶剂种类对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

分别准确称取2.00 g澳洲坚果叶片置于150 mL三角瓶，按料液比为1∶40（g/mL）分别加入40%甲醇、水、40%丙酮、40%乙醇，于提取温度40℃、磁力搅拌速度150 r/min条件下提取90 min。提取结束后按1.3.1进行操作。

1.3.2.2 乙醇浓度对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

准确称取2.00 g澳洲坚果叶片置于150 mL三角瓶，分别加入浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇作为提取溶剂，在料液比1∶40（g/mL）、提取温度在40℃条件下提取60 min。提取结束后按

1.3.1 进行操作。

1.3.2.3 提取温度对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

准确称取2.00 g澳洲坚果叶片置于150 mL三角瓶，按料液比为1∶40（g/mL）加入40%乙醇，分别在20、30、40、50、60、70 ℃条件下提取 60 min。提取结束后按1.3.1进行操作。

1.3.2.4 料液比对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

准确称取2.00 g澳洲坚果叶片置于150 mL三角瓶，分别按料液比为 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1∶60（g/mL）加入40%乙醇，在提取温度为50℃条件下提取60 min。提取结束后按1.3.1进行操作。

1.3.2.5 提取时间对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

准确称取2.00 g澳洲坚果叶片置于150 mL三角瓶，按料液比为1∶40（g/mL）加入40%乙醇，在50℃条件下分别提取 10、15、20、25、40、60 min。提取结束后按1.3.1进行操作。

1.3.3 正交试验设计

在1.3.2单因素试验基础上，以总酚提取量为考察指标，进行L9（34）正交试验。因素水平设计如表1所示。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factor level of orthogonal tests

1.3.4 总酚提取量的测定方法

取0.2 mL澳洲坚果叶片提取液于15 mL离心管，然后依次加入5.8 mL去离子水、2 mL 10%福林酚试剂和2 mL 10%Na2CO3，充分混合后避光反应45 min，于765 nm处测吸光值，平行测3次。以没食子酸为标准物质制作标准曲线：Y=0.107 9X+0.011（R2=0.999 1。式中：Y为吸光值；X为没食子酸标准溶液浓度，mg/L）。澳洲坚果叶片总酚提取量计算公式如下[15]：

澳洲坚果叶片总酚提取量/（mg/100 g）=50X·V/（10M）

式中：X为标准曲线查得的没食子酸浓度，mg/L；V为提取液体积，mL；M为样品质量，g。

1.3.5 抗氧化能力测定方法

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

将澳洲坚果叶片提取液按不同浓度梯度进行稀释，分别取稀释后的澳洲坚果叶片提取液2.0 mL于10 mL离心管，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，充分混合后避光反应30 min，于517 nm处测吸光值As；空白对照吸光值记为A0。以Trolox为阳性对照，平行测3次。通过以下公式计算澳洲坚果叶片总酚与Trolox对DPPH自由基的清除率（P），并计算半数清除率IC50[16]。

1.3.5.2 总抗氧化还原能力的测定

总抗氧化还原能力采用检测试剂盒（FRAP法）进行测定，具体步骤如下：取180 μL FRAP工作液（TPTZ稀释液、TPTZ溶液以及缓冲液按体积比为10∶1∶1充分混合即为FRAP工作液）加入96孔板的检测孔，再分别加入5 μL不同浓度FeSO4溶液，于37℃水浴中反应5 min，593 nm处测吸光值，平行测3次。通过吸光值与FeSO4溶液浓度的关系制作标准曲线，并计算澳洲坚果叶片总酚的当量浓度。

1.4 数据统计与分析

每组试验均进行3次重复，结果取平均值。试验数据用SPSS 17.0软件进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取溶剂种类对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

溶剂种类是影响植物活性物质提取率的主要因素之一[17]。提取溶剂种类对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响见图1。

由图1可知，在设定试验条件下，总酚提取量由高到低依次为：40%丙酮、40%乙醇、40%甲醇、水。这可能是提取溶剂极性不同导致了对酚类物质的溶解差异。此外，提取溶剂对植物次级代谢产物的溶解也会竞争酚类物质与提取溶剂-水的结合，从而造成酚类物质提取差异[18]。由显著性分析可知，提取溶剂为40%乙醇时总酚提取量与40%丙酮无显著差异（p＞0.05），且与丙酮相比，乙醇毒性及价格较低。综合考虑，选取乙醇为提取溶剂对澳洲坚果叶片酚类物质进行提取。

图1 提取溶剂种类对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响Fig.1 Effects of extraction solvents on total phenol content from macadamia leaves

2.1.2 乙醇浓度对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

乙醇浓度对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响见图2。

图2 乙醇浓度对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on total phenol content from macadamia leaves

由图2可知，乙醇浓度为20%～70%时，澳洲坚果叶片总酚提取量随乙醇浓度增加呈先增加后减少的趋势。当乙醇浓度为40%时，总酚提取量达到最大，为1 056.48 mg/100 g，且与其他条件存在显著性差异（p＜0.05）。乙醇浓度对酚类物质提取具有双重作用：一方面，水分使物料细胞溶胀增加，增加了溶剂向细胞的渗透，从而加大了溶剂与物料的接触面积，故总酚提取量随乙醇浓度增加而增加[19]；另一方面，与高浓度乙醇溶液相比，低浓度乙醇溶液中水分比例较高，故极性较大，而总酚是一类极性物质的结合，因此乙醇浓度超过一定范围时，与目标物质极性差异增大，从而总酚提取量随乙醇浓度增加而减少[20]。Pattrathip等[21]的研究表明乙醇浓度为55%时，酸橙皮中酚类物质提取量最高，本试验与其趋势一致。同时，由于浓度增加，会导致溶剂使用量及成本增加，故乙醇浓度宜选为40%。

2.1.3 提取温度对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

提取温度对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响见图3。

图3 提取温度对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on total phenol content from macadamia leaves

由图3可知，在20℃～70℃范围内，澳洲坚果叶片总酚提取量随温度升高而增加。这可能是由于提取温度升高，提取溶剂与材料之间的传质增强，目标化合物的溶解度增加，从而总酚提取量增加[22]。同时，由图3可知，在30℃～50℃范围内，提取温度对澳洲坚果叶片总酚提取量具有显著性影响（p＜0.05）；在50℃～70℃范围内，提取温度对澳洲坚果叶片总酚提取量无显著性影响，且当提取温度从50℃升高到70℃时，澳洲坚果叶片总酚提取量仅增加33.34 mg/100 g。此外，温度升高会引起溶剂挥发以及能耗增加，故提取温度宜选为50℃。

2.1.4 料液比对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

料液比对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响见图4。

料液比是影响生物活性物质提取的重要因素之一，其主要通过溶解度和平衡常数的改变影响目标化合物得率。由图4可知，料液比对澳洲坚果叶片总酚提取量具有显著影响（p＜0.05）。随料液比增加，澳洲坚果叶片总酚提取量先增加后减少，当料液比为1∶50（g/mL）时，澳洲坚果叶片总酚提取量最高，为1 108.72 mg/100 g。料液比在一定范围内，料液比增加，传质推动力增加，扩散速率增加，从而提取量增加[23]；而超过一定范围时，色素等杂质的传质增加，会抑制总酚向提取溶剂中扩散，从而提取量减少。本研究与前期对澳洲坚果青皮中酚类物质提取研究趋势一致[9]。综合考虑，料液比宜选为1∶50（g/mL）。

图4 料液比对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响Fig.4 Effects of solid to solvent ratio on total phenol content from macadamia leaves

2.1.5 提取时间对澳洲坚果叶片酚类物质提取的影响

提取时间对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响见图5。

图5 提取时间对澳洲坚果叶片总酚提取量的影响Fig.5 Effects of extraction time on total phenol content from macadamia leaves

由图5可知，澳洲坚果叶片总酚提取量随提取时间增加而增加，当提取时间大于25 min时，澳洲坚果叶片总酚提取量增加不显著（p＞0.05）。这可能是因为：随提取时间增加，传质推动力逐渐减小，总酚在提取溶剂中逐渐达到溶解平衡；同时，在酚类物质向提取溶剂扩散的过程中，酶降解以及氧化等反应会造成酚类化合物破坏，从而提取时间超过一定范围时，其对酚类物质提取影响不显著。本研究与Una-Jovana Vaji等[24]的研究结果相近，其研究表明在提取时间大于30 min时，酚类物质提取量增加不显著。由于提取时间增加，会导致能耗等增加，因此，提取时间宜选为25 min。

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2极差分析可知，4个因素对澳洲坚果叶片酚类物质的影响顺序依次为：料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度，澳洲坚果叶片酚类物质提取的最优条件为A2B3C3D3，即乙醇浓度为40%，提取温度为60 ℃，料液比为1∶60（g/mL），提取时间为 25 min。正交试验组内不包含此组合，故需进行验证试验。经验证试验，在最佳提取工艺条件下，澳洲坚果叶片总酚提取量为1 176 mg/100 g。

2.3 澳洲坚果叶片总酚抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力

澳洲坚果叶片总酚与Trolox对DPPH自由基的清除作用见图6。

图6 澳洲坚果叶片总酚与Trolox对DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging ability of total phenols from macadamia leaves and Trolox on DPPH

由图 6 可知，在 2 mg/L～10 mg/L、1.25 mg/L～15 mg/L浓度范围内，澳洲坚果叶片总酚与Trolox对DPPH自由基的清除率与浓度呈线性关系，拟合得到线性方程：Y1=5.885 0X1+7.446 0（R2=0.991 2）；Y2=5.006 3X2-0.806 6（R2=0.999 5）。通过线性方程计算，澳洲坚果叶片总酚与Trolox对DPPH自由基的半数清除率IC50分别为7.23、10.15 mg/L，其中，IC50指DPPH自由基清除率为50%时的浓度。由此表明，澳洲坚果叶片酚类物质具有较强的抗氧化活性，且优于Trolox。

2.3.2 总抗氧化还原能力

总抗氧化能力标准曲线见图7。

图7 总抗氧化能力标准曲线Fig.7 Standard curve of total antioxidant capacity

FRAP法是待测样品中抗氧化成分在酸性条件下将Fe3+还原为蓝色Fe2+，在一定波长条件下测其吸光值，吸光值越大，则表示抗氧化能力越强。通过FeSO4溶液浓度与吸光值的关系，以FeSO4溶液浓度（mg/L）为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线：Y=0.309 4X+0.016 9（R2=0.993 4）。当澳洲坚果叶片总酚及Trolox浓度分别为200 mg/L时，FeSO4当量浓度分别为2.40、1.72 mmol/L，表明澳洲坚果叶片总酚具有较强的总抗氧化还原能力。

3 结论

本研究通过正交试验以及极差分析，得到澳洲坚果叶片酚类物质最佳提取工艺条件：乙醇浓度40%、提取温度 60℃、料液比 1∶60（g/mL）、提取时间 25min，此时提取量为1 176 mg/100 g。通过与Trolox和FeSO4对比，澳洲坚果叶片酚类物质在体外对DPPH自由基具有较好的清除效果。此研究可为后续酚类物质分离纯化以及抗氧化机制研究奠定试验基础。