外泌体作为肿瘤诊断生物标记物的研究进展

姜良弟，顾永卫综述，刘继勇审校

0 引 言

外泌体是源于内体系统的纳米级细胞外囊泡(30～150 nm)，由多种细胞分泌，如红细胞、树突状细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞和肿瘤细胞等[1]。外泌体分布在多种体液中，如血浆、血清、尿液、胸膜液、唾液、羊水和乳汁等[2-3]。外泌体携带细胞质蛋白、核酸、脂质和代谢物等物质，可传递细胞间信号，调控生物体的病理生理过程[3]。因此，外泌体作为肿瘤诊断生物标志物已成为肿瘤研究与转化的热点。肿瘤来源的外泌体(tumor-derived exosomes，TEXs)是肿瘤细胞释放的外泌体亚群，通过建立或改变肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)促进肿瘤血管生成和转移，抑制宿主细胞免疫反应，调节免疫逃逸和多药耐药性[4]。TEXs携带多种内源性货物，部分内容物类似于亲代细胞并反映其病理生理状态，可提供与肿瘤相关的多种生物分子，这使其可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物。

1 生物发生

外泌体起源于内体系统。起初，细胞质膜向内凹陷形成初级内体，在高尔基体的参与下成为次级内体和多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)，MVBs膜向内出芽形成腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)[5]。最终，MVBs被溶酶体降解或在Rab GTP酶的参与下与细胞膜融合将ILVs释放到细胞外[6]，见图1。转运所需内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)调控外泌体的形成和内容物分选[7]。外泌体的形成也可通过ESCRT非依赖性途径。例如，神经酰胺也可触发内体囊泡向内出芽形成MVBs[8]。

图1 外泌体的生物发生

Figure 1 Biogenesis of exosomes

2 结构与组成

外泌体由亲脂性外壳和亲水性内核组成，其物质组成根据亲本细胞的病理生理状态以及外部刺激而变化[9]。四跨膜蛋白和整合素是普遍存在于外泌体表面上的融合和靶向蛋白。四跨膜蛋白调节细胞间信号转导和黏附分子的功能[10]；整合素控制外泌体的器官靶向性转移[11]。见图2。外泌体膜中含有胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酸和磷脂酰甘油等脂类成分[12]。外泌体还含有多种功能性核酸，包括信使RNAs(messenger RNAs，mRNAs)、环状RNAs (circular RNAs，circRNAs)、微小RNAs (microRNAs，miRNAs)、非编码小RNAs(small non-coding RNAs，sncRNAs)、长链非编码RNA (long non-coding RNAs，lncRNAs)和双链DNA (double-stranded DNA，dsDNA)[13-18]。

图 2 外泌体的结构与组成

Figure 2 Structure and composition of exosomes

3 外泌体与肿瘤诊断

3.1 外泌体蛋白作为标志物外泌体富含肿瘤相关蛋白，可作为肿瘤诊断循环标记物[19]。Melo等[20]最早证明，胰腺癌患者血清外泌体中存在大量过表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC 1)。此外， GPC 1与肿瘤负荷、患者的术前和术后存活率密切相关，证明了外泌体蛋白用于胰腺癌早期诊断的可行性。Fu 等[21]通过质谱技术鉴定了胃癌患者和健康个体的血清外泌体中243种差异表达的蛋白。更关键的是，与健康个体相比，胃癌患者血清外泌体及胃癌组织中的含三联基元蛋白3(tripartite motif containing protein 3，TRIM3)表达显著降低，表明TRIM3可作为胃癌的诊断标志物。

近期研究表明，血浆外泌体磷酸化蛋白能提供肿瘤进展的实时信息，可作为肿瘤早期诊断、筛查与监测的有效手段。Chen等[22]鉴定了微泡和外泌体中的9643种磷酸化蛋白质。结果显示，与健康个体相比，乳腺癌患者外泌体中的144种磷酸化蛋白显著高表达。然而，磷酸化蛋白作为循环标记物，需要大量高纯度的外泌体，受到磷酸化特异性抗体的限制，同时生物体液的复杂性及分离技术的局限性也会对外泌体磷酸化蛋白用于肿瘤临床诊断带来挑战[22]。

外泌体会选择性地富集肿瘤特异性蛋白，检测这些蛋白可能有助于肿瘤的诊断、预后和化疗评估。然而，肿瘤外泌体特异性蛋白丰度较低且易受其他蛋白的污染，其临床诊断应用性有待提高[23]。

3.2外泌体核酸作为标志物

3.2.1 miRNAs外泌体含有与肿瘤进展相关的多种 miRNAs，也可用于肿瘤诊断与预后[24-25]。例如，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者和肝硬化患者的血清miR-221、miR-222和miR-224的表达谱相似，然而HCC患者血清外泌体中这3种miRNAs的表达水平显著高于肝硬化患者，因此外泌体miRNAs可能是比血清miRNAs更灵敏的生物标志物[26]。去势抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer, CRPC)患者血浆中高水平表达的外泌体miR-1290和miR-375与其较差的总体生存率相关，可作为CRPC的预后标记物[27]。此外，miRNAs也是比糖类抗原(carbohydrate antigen，CA)更灵敏的标志物，例如，外泌体miRNAs比单独的CA 19-9或GPC 1在诊断胰腺癌、区分胰腺导管腺癌和慢性胰腺炎方面灵敏度更高[28]。

外泌体miRNAs具有较高的特异性和灵敏度，是一种用于肿瘤诊断和预后的新途径，但也存在一定局限性，例如其表达水平的强烈变化[29]。因此需要在更多类型和不同阶段的肿瘤样本中进一步验证其作为肿瘤标志物的准确性。此外，研发标准化的高通量miRNAs检测方法也是目前需要考虑的问题。

3.2.2lncRNAs外泌体lncRNAs在肿瘤诊断方面也有一定的应用。例如，膀胱癌(bladder cancer，BC)患者血清外泌体lncRNA-UCA1的水平与健康个体相比明显升高。同时，BC细胞通过分泌含有致癌性lncRNA-UCA1的外泌体重塑TME，从而促进肿瘤转移[30]。尿液外泌体相关lncRNAs的水平上调与非肌肉浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)较差的总生存期相关，在BC诊断和预后中具有重要的应用价值[31]。多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者血清外泌体HOX 转录反义 RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)的表达水平比健康个体更高，可用于监测治疗反应和复发情况，并作为GBM对溴结构域和末端外蛋白抑制剂的反应型分子标志物[32]。此外， HOTAIR的过表达与乳腺癌患者的低生存率和化疗耐药相关，可作为乳腺癌的诊断标记物[33]。

3.2.3circRNAs研究表明，外泌体circRNAs可作为肿瘤诊断与筛查的指标[34]。Li等[35]最早证实人血清外泌体中存在超过1000个完整且稳定的circRNAs。此外，部分血清外泌体circRNAs可用于结肠癌的临床诊断。近期研究表明环状RNA IARS(circular RNA IARS，circ-IARS)存在于胰腺癌外泌体中，其过表达能引发一系列促癌行为，包括显著上调致癌基因、F-肌动蛋白和黏着斑的表达；下调纤连蛋白的表达，从而促进肿瘤的侵袭转移[36]。

外泌体circRNAs由于结构稳定、表达广泛、序列保守和含量丰富而易于检测。然而， circRNAs的调节机制和分子选择机制在很大程度上仍未知[14]。此外，还需要进一步阐明外泌体circRNAs的基因调控机制、表达模式以及与肿瘤耐药性之间的关系。

3.2.4mRNAs尽管外泌体mRNAs的丰度较低，但其仍携带关于基因表达和突变的重要信息，可作为肿瘤诊断和治疗的辅助手段[37]。例如，HCC患者血清外泌体hnRNPH1的水平比其他对照组明显升高并与Child-Pugh分级、淋巴转移和总生存期相关，可作为HCC诊断的候选标记物[38]。此外，研究证明血浆外泌体程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1) mRNAs的表达与黑色素瘤和非小细胞肺癌的抗PD-1抗体治疗反应密切相关，这使外泌体mRNAs成为肿瘤免疫治疗的分子标志物，可能用于指导肿瘤化疗合理用药[39]。

3.2.5DNA外泌体DNA也逐渐用于临床诊断，可实现对肿瘤的纵向监测、评估和分层[40]。Thakur等[18]证实了TEXs含有代表整个基因组并反映亲本细胞突变信息的dsDNA。Wang等[41]在比较嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PCC)和副神经节瘤(paraganglioma，PGL)患者的血清外泌体DNA和肿瘤组织DNA时发现外泌体中存在部分与配对致癌基因组高度一致、能反映易感基因突变状态并覆盖大部分染色体基因的dsDNA片段，这表明外泌体dsDNA可作为PCC和PGL诊断和术前评估的非侵入性基因标记物。

外泌体DNA结构稳定，可以实时准确地反映肿瘤进展状态。此外，它还在肿瘤微小残留病变和复发早期预警方面具有潜在的临床应用价值。然而，由于肿瘤特异性DNA会被正常细胞DNA污染，从而影响其诊断灵敏度。因此，在作为液体活检手段的外泌体DNA用于临床诊断前，需要选择性地富集肿瘤特异性外泌体[42]。

3.3外泌体糖复合物作为标志物

3.3.1 糖蛋白血液中大多数蛋白质是糖蛋白，而肿瘤细胞的糖蛋白会发生异常糖基化，因此糖蛋白可用于肿瘤诊断和监测。血浆/血清蛋白质组含有12个数量级的动态蛋白浓度范围且成分较复杂，因此血浆/血清糖蛋白不适合作为疾病标志物[43]。然而，分析外泌体糖蛋白可在很大程度上消除高丰度血浆或血清成分的干扰，使低含量的糖蛋白能够在较宽的动态范围内被检测到[44]。Chen 等[45]开发了基于聚合物的反相糖蛋白阵列技术，鉴定了乳腺癌患者血浆外泌体中20种高表达的糖蛋白，也证明了外泌体糖蛋白作为癌症标志物的可行性，同时也解决了如何高通量地验证特异性糖蛋白的问题。

3.3.2糖脂外泌体糖脂也可作为肿瘤生物标志物。例如，前列腺癌(prostate cancer，PCa)细胞外泌体相比于其他对照细胞含有更丰富的鞘糖脂，如己糖神经酰胺和乳糖神经酰胺[46]。外泌体糖蛋白和糖脂作为生物标志物不仅有助于阐明恶性肿瘤的发展机制及其生物学特性，而且增加了现有临床肿瘤标志物的特异性和灵敏性，可能会成为肿瘤诊断和精准医疗的利器[47]。

3.4外泌体脂质作为标志物脂质在肿瘤细胞生长和代谢中不可或缺，其代谢异常也与肿瘤的进展、转移和侵袭密切相关[48]。早期研究证明尿磷脂成分能作为 PCa的诊断标志物[49]。Skotland 等[50]通过高通量质谱定量脂质组学鉴定了PCa患者和健康个体中的107种外泌体脂质成分。结果表明，尿液外泌体和PCa细胞外泌体之间的胆固醇和磷脂酰胆碱含量有显著差异。更重要的是，磷脂酰丝氨酸和乳糖神经酰胺在两种外泌体之间表现出更明显的含量差异，表明外泌体脂质可作为PCa的非侵入性生物标志物。

4 展 望

随着外泌体的生物发生及其功能相关知识的不断深入，外泌体作为“液体活检”手段的研究越来越多。然而，大部分肿瘤外泌体的研究处于早期阶段，对肿瘤特异性标记物富集机制尚未完全了解，大多数研究只是在特定时间分析一种外泌体标记物，而忽略了其他因素。此外，外泌体的分离纯化方法也尚未标准化，这是限制外泌体诊断研究的主要因素。目前，已经开发出多种分离纯化外泌体的技术，包括超速离心、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱、微流控和免疫亲和捕获等[51]。然而，分离方法的不同会导致外泌体定性和定量的差异，使不同研究组之间的结果难以比较或重现。因此，应该建立与外泌体分离检测相关的标准操作流程和开发外泌体肿瘤特异性标记物的鉴定模式，以提高外泌体肿瘤临床诊断的准确性和灵敏度。随着分离检测技术的标准化与新型外泌体标记物的发现，外泌体将在肿瘤诊断、治疗和预后评估方面拥有广阔的应用前景。