基于谱-效关系探究黄芩抑制白色念珠菌的质量标志物

商利娜 王亚静 ∗赵 鑫赵海宁周梦楠张 怡高 迪王雁雯叶相印

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津301617； 2.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津301617）

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其性寒，味苦，归肺、胆、脾、大肠、小肠经［1］，最早记载于《神农本草经》，具有清热祛湿、泻火解毒等功效；现代药理学表明，黄芩提取物具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗炎、抗氧化等作用［2-3］，对多种致病菌的抑制作用是其重要药效物质基础之一。黄芩苷是黄芩中含有量最高的成分，也是2015 年版《中国药典》 规定的质量控制成分。

目前，黄芩提取工艺及质量控制大多是根据《中国药典》 或文献，以黄芩苷或总黄酮为指标［4-6］，但也有对黄芩谱-效关系进行研究的报道，发现其抑制金黄色葡萄球菌关联性最强的成分是白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，而不是黄芩苷［7］。因此，应制定适宜的方法进行相关分析，以提高黄芩质量控制的科学性。

另有研究表明，黄芩对白色念珠菌具有一定抑制作用。白色念珠菌是一种常见的条件性真菌病原体，当机体抵抗力低下或菌群失调时它会大量繁殖并形成芽生菌丝，侵犯皮肤、黏膜或内脏，引起鹅口疮、外科伤口感染、真菌血症等疾病［8-9］，但目前黄芩抑制白色念珠菌的质量标志物仍不清晰，因此有必要对相关质量标志物进行考察。

中药质量标志物是在中药材和中成药中固有的或加工过程中形成的、与中药功能属性密切相关的化学物质，是反映中药质量和药效的存在［10］；中药指纹图谱是反映中药所含所有化学成分种类和数量的一种形式，在一定程度上可揭示其化学特征，目前已成为中药质量评价的有效方法，但它仅能反映化学信息，并不能体现与药效学相关的具体成分［11］，故若要科学评价中药质量，就应开展指纹图谱与药效的相关性研究，即谱-效关系。

灰色关联分析是一种用于中药质量评估的相关性分析方法，可定量描述事物或因素之间关联性的大小，也能反映各指标性成分对药效的贡献程度［12-13］。因此，本实验采用该方法对黄芩进行谱-效关系研究，根据各成分贡献程度来确定该药材抑制白色念珠菌的质量标志物。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置Agilent 20RBAX Eclipse Plus 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；LS-B50 L 立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）；SW-CJ-JF 垂直层流超净工作台 （苏州净化厂）；HPX-9052MBE 电热恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；Infinite 200 PRO 多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；FA124 电子天平（天津亿诺科学仪器有限公司）；YP1001电子天平（上海箐海仪器有限公司）；AX205 电子天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；默克纯水机（天津信睿生物科技有限公司）；N-1210B 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 黄芩饮片 （批号190102，产地山西） 购自河北安国市誉林药业有限公司，经专家鉴定为正品。黄芩苷 （批号P20A9F59353）、黄芩素 （批号C20MBY31962）、汉黄芩 素 （批 号W30M10284622）、橙皮苷（P06D9F77001） 对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；汉黄芩苷对照品（批号823B022） 购于北京索莱宝科技有限公司。乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水。

1.3 菌种与培养基 白色念珠菌 ［编号BNCC337321（＝ATCC1231）］ 购自北纳创联生物技术有限公司。改良马丁琼脂培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司；改良马丁培养基购自山东拓普生物工程有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液 精密称取4 份药材粗粉，每份10 g，加入水或60%乙醇200 mL，以回流水提取、回流60%乙醇提取、温浸水提取、温浸60% 乙醇提取4 种方式各提取2 h，提取液放凉后，对应溶剂补足减失的质量，离心弃去药渣，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得，4 ℃下备用。

2.1.2 内标溶液 精密称取橙皮苷对照品1.47 mg，甲醇定容至25 mL，即得（质量浓度为58.8 μg／mL），4 ℃下备用。

2.1.3 对照品溶液 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.516、1.000、0.506、0.515 g／L 的贮备液，各吸取1 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超声混匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 抑菌用供试品溶液 取“2.1.1” 项下药液适量，旋蒸至生药量1 g／mL，即得。

2.1.5 试验用菌液 将白色念珠菌冻干粉进行复苏、活化、传代至第3 代，取10 μL 加到10 mL 改良马丁液体培养基中，于30 ℃恒温培养箱中静置培养24 h，即得（菌浓度为1×107CFU／mL）。

2.2 HPLC 指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～25 min，85%～75% B；25～40 min，75%～70% B；40～45 min，70%～60% B；45～60 min，60%～57% B；60～65 min，57%～30% B；65～70 min，30%～85%B；70～75 min，85% B）；体积流量1 mL／min；检测波长202 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2.2 图谱分析 对照品溶液用0.45 μm 微孔滤膜过滤后，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1A；取“2.1.1” 项下供试品溶液1 mL 于5 mL 量瓶中，对应溶剂定容至5 mL，取1 mL，与1 mL “2.1.2” 项下内标溶液混合，0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1B。

图1 对照品HPLC 色谱图及供试品HPLC 指纹图谱

2.3 体外抑菌实验 根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 操作规范，采用微量肉汤稀释法［3，14］进行测定，设置实验组、阴性对照组、阳性对照组、空白对照组。取无菌96 孔板，在A1～A11 孔中分别加入1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 g／L 药材提取液100 μL，再分别加入100 μL 稀释至1×104倍的白色念珠菌菌液，使每孔终质量浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 g／L，作为实验组；B1～B11孔中依次加入质量浓度为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 g／L 药材提取液100 μL，再分别加入100 μL 改良马丁液体培养基，作为阴性对照组；A12 孔中加入灭菌水、稀释至1×104倍的菌液各100 μL，作为阳性对照组；B12 孔中加入灭菌水、改良马丁液体培养基各100 μL，作为空白对照，每组平行3 次，将96 孔板置于酶标仪中测定600 nm 波长下的吸光度（A），计算抑菌率，公式为抑菌率＝［1-（A实验组-A阴性对照组） ／（A阳性对照组-A空白对照组）］ ×100%。

2.4 药材指纹图谱数据及抑菌效果 药材指纹图谱数据以各标志峰峰面积与内标物峰面积的比值表达，抑菌效果以供试品溶液质量浓度为7.81 g／L 时的抑菌率来表达（7.81 g／L为药材抑制白色念珠菌的最低抑菌浓度，此时4 种提取方式下的抑菌率具有显著差异），结果见表1。

2.5 灰色关联分析 参考文献［7，15-16］ 报道的方法。

2.5.1 参考序列、比较序列确定 本实验考察不同提取工艺下药材提取液中各成分（即各组分峰面积） 对白色念珠菌抑菌率的影响程度，以抑菌率为参考序列（母序列），记作X0（k），k＝1、2、3、4；以27 种成分峰比值为比较序列（子序列），记作Xi（k），i＝1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4。

2.5.2 无量纲化处理 为了确保实验结果准确性，便于各指标比较，在计算灰色关联度之前需要对数据进行无量纲化处理。本实验研究采用均值化法，即用各序列元素分别除以相应序列平均值，计算公式为i＝0、1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4。其中为序列i的样本数据平均值，Xi（k） 为原数据，Xi′ （k） 为无纲量化处理后的数据，从而得到均值化的序列｛Xi′ （k） ｝。

表1 药材指纹图谱数据及抑菌效果

2.5.3 求差数列建立 计算参比序列与比较序列的绝对差值ΔXi（k），计算公式为

2.5.4 关联系数确定 灰色关联系数ζi（k） 表示参考序列X0和比较序列Xi在k（k＝1、2、3、4） 时的关联程度，计算公式为ξi（k）＝（i＝0、1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4），式中｜X0（k） -Xi（k） ｜ 为序列X0与序列Xi在k点差值的绝对值；为差值绝对值的二级最小值，即在各序列差值最小值的基础上，进一步得出所有序列的差值最小值；为差值绝对值的二级最大值，即在各序列差值最大值的基础上，进一步得出所有序列的差值最大值；ρ为分辨系数，取值区间为（0，1），本实验取ρ＝0.5。

2.5.5 灰色关联度计算 灰色关联度γ0i计算公式为，式中n为任一序列i下的样本数，本实验取n＝4。

2.5.6 关联极性分析 序列Xi′ （k） 与X0′ （k） 之间的关联极性 σi计算公式为（i＝1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4，n＝4）。若sgn （σi） ＝sgn （σ0），则Yi与Y0正关联，即前者对后者起到增强作用；若sgn （σi） ＝-sgn （σ0），则Yi与Y0负关联，即前者对后者起到削弱作用，sgn （X）为符号函数，即

2.6 分析结果 按“2.5” 项下方法对谱-效关系进行分析，结果见表2，可知除了成分1、3、8、10、12、14、21、22、26 对抑菌起到削弱作用外，其他成分都起到促进作用，各成分对抑菌率的影响程度见图2～3。在促进抑菌活性的成分中，关联度最强的是峰24 （黄芩素），其关联度为0.768 9；对削弱抑菌活性的成分中，关联度最强的是峰22，其关联度为0.624 7，即峰24 （黄芩素）、峰22 分

表2 抑菌质量标志峰与抑菌率之间的关联度

图2 对抑制白色念珠菌起促进作用的成分及其贡献程度

图3 对抑制白色念珠菌起削弱作用的成分及其贡献程度

3 讨论

白色念珠菌是一种条件致病性真菌，是真菌感染的最常见原因之一，并且具有显著的死亡率。黄芩具有显著抑制白色念珠菌的活性，而且它属于天然中药产物，不易产生耐药性，故本实验旨在考察该药材相关质量标志物。

中药质量标志物（Q-marker） 是中药质量控制的一个新概念，其核心内容包括有效、特有、传递与溯源、可测、处方配伍［17］，其中有效最为重要。目前，已有文献表明黄芩苷、黄芩素等单体成分对白色念珠菌具有抑制作用［19-20］，本实验印证了这一点，但更着重对黄芩提取物中各成分对抑菌效果的强弱进行研究，并将贡献程度最大的黄芩素作为质量标志物。中药是否有效与其化学成分、提取工艺等因素密不可分，故本实验设置4 种提取方式使其化学成分及药效（抑菌率） 具有显著差异，以便通过谱-效关系确定该药材抑制白色念珠菌的质量标志物。

中药化学成分十分复杂，并非所有成分在疾病治疗中都起着同样重要的作用，故需应用一种合适的方法对谱-效关系进行研究，以便得到在药效学中发挥作用的贡献者。中药谱-效关系的研究方法很多，如灰色关联分析、相关分析、聚类分析、偏最小二乘法分析等，其中灰色关联分析具有样本量小、计算量小、结果与定量结果一致等优点［12］。因此，本实验采用灰色关联分析法对黄芩的“谱-效” 关系进行研究，发现其中抑制白色念珠菌关联性最强的成分是黄芩素，而不是含有量最高的黄芩苷。因此，针对中药中每种特定成分的药效，均需要制定合适的方法对其谱-效关系进行分析，以便确定其质量标志物。

本实验首次采用谱-效结合模式，从抑菌差异性特点的角度出发，对黄芩进行质量综合评价体系研究，并通过灰色关联分析对不同提取工艺所得黄芩HPLC 指纹图谱与药液对白色念珠菌的抑制作用进行关联，明确了该药材抑菌物质基础的关联程度。结果，初步确定了黄芩抑制白色念珠菌的主要质量标志物是黄芩素，其药效发挥是多种成分共同作用的结果，可为该药材提取工艺优化、质量控制建立等方面的研究提供可行性参考。但本实验结果与目前黄芩质量控制指标（黄芩苷） 不完全符合，具体原因仍需进一步探讨。