液体活检技术在肺癌诊疗中的研究进展▲

史琳娜 吕蕊花 贾永军 任 革 韩 冬 张宏方 贺太平

(1 陕西中医药大学医技学院，西咸新区 712046，电子邮箱：selina-007-520@163.com；2 陕西中医药大学附属医院影像科，咸阳市 712000)

【提要】 液体活检是一种非侵入性的新型诊断技术，主要检测体液中的游离循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体、循环RNA等生物标志物，被广泛用于疾病分子诊断、疗效监测和预后评估。近年来，随着研究的深入及检测技术的发展，液态活检在肺癌诊疗中的应用日益广泛。本文就近年来液体活检技术在肺癌诊疗中的研究进展进行综述。

肺癌是导致全球癌症相关发病率和死亡率上升的主要原因，早期诊断率仅为15%，约75%的患者确诊时已处于局部晚期或转移阶段[1]。目前，临床常用的肺癌筛查方法主要包括痰脱落细胞学检查、支气管镜检查、胸部X光、低剂量计算机断层扫描和肺组织活检等[2]。痰脱落细胞学检查具有无创、经济、实用、简单、快速的优点，但敏感性差[3]。支气管镜检查是诊断疑似肺癌患者的主要方法，属于侵入性的诊疗方法，并发症多且敏感性个体差异较大[4]。胸部X光检查不能完全显示肺部病变，假阴性率高，敏感性为75%～80%[5]。低剂量计算机断层扫描检测肺部病变敏感性较高，但假阳性率亦高，且有辐射暴露的风险[6]。肺组织活检所需的组织样本需通过手术获得，取样不足和肿瘤内部的异质性可降低检测的准确性[7]。液体活检是一种非侵入性的新型诊断技术，相较于其他肺癌筛查方法，具有无创、标本易获得且可重复获取的优点，可用于肺癌的精准治疗、预后评估和疗效监测[8]。液体活检检测对象主要包括游离循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、外泌体及循环RNA。其中CTC和ctDNA检测是发展最迅速的两个研究领域。本文对液体活检在肺癌诊疗中的研究进展进行综述，以期为肺癌的精准医疗提供更好的参考。

1 CTC

1.1 CTC的概念及检测方法 CTC是从原发性肿瘤和/或转移病变脱落并在血流中循环的肿瘤细胞，细胞表面可表达上皮细胞特异性分子，如上皮细胞黏附分子和细胞角蛋白，低表达白细胞特异性分子CD45[9]。与其他循环肿瘤生物标志物相比，CTC的优势是可通过直接观察CTC细胞形态确定肿瘤的恶性表型。此外，免疫细胞化学和荧光原位杂交可用于CTC的表型鉴定并检测基因组变化。体外培养CTC建立永久性CTC细胞系，可用于各种体内、体外的功能实验，并可用于药物筛选，有助于肿瘤的个体化治疗[10]。外周血中的CTC含量极低[1～10 CTC/(106血细胞·mL 血)]，因此，CTC分选富集技术是临床应用的重点和难点。目前CTC分选富集常用的方法有亲和性富集法(包括上皮细胞因子阳性富集法和白细胞去除法)、膜滤过分离肿瘤细胞技术、密度梯度离心法、微流控芯片技术、免疫磁珠技术、电泳技术、免疫荧光法等，各有优缺点[11]，见表1。

表1 CTC分选富集技术的优缺点比较

1.2 CTC临床应用进展 CTC包含多种细胞和亚细胞成分，通过分析其组分可获取肿瘤的病变信息，如获取DNA分析已知突变和发现新突变，获取RNA可得到基因表达谱及进行肿瘤细胞蛋白质组学分析，CTC在肺癌的诊断、治疗评估和复发监测等方面具有潜在的应用价值，已广泛应用于临床前研究和临床试验[11]。研究发现叶酸受体阳性的CTC可用于肺癌的早期诊断，其诊断Ⅰ期肺癌的敏感性和特异性分别为74.19%和73.08%，其受试者工作特征曲线的曲线下面积优于癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶、细胞角蛋白19片段等其他临床肿瘤标志物[12]。尽管化疗、靶向小分子和免疫检查点抑制剂治疗肺癌已显示出显著效果，但获得性耐药和肿瘤复发仍旧十分常见。Zhou等[13]的研究证实了CTC计数与肺癌患者癌胚抗原表达水平和转移灶数量呈正相关，并能有效预测预后。Chinniah等[14]对48例接受化疗的局部晚期肺癌患者进行纵向血液CTC监测，证实CTC可预测肿瘤复发并先于影像学证据出现。因此，通过连续取样，对患者CTC进行纵向分析、监测肿瘤的演变，对肿瘤耐药和复发研究具有重要意义[15]。

2 ctDNA

2.1 ctDNA的概念及检测方法 ctDNA是从凋亡或坏死的肿瘤细胞中释放出来的遗传物质，可反映肿瘤的遗传特征。研究证实，ctDNA与肿瘤组织活检中获得的肿瘤突变谱具有较高的一致性，可作为治疗效果评价指标与治疗后临床随访的重要监测指标[16]。目前，ctDNA检测技术主要包括等位基因特异性PCR、数字PCR和二代测序技术，每种技术都有各自的优缺点[17]，见表2。

表2 ctDNA检测方法的优缺点比较

2.2 ctDNA临床应用进展 ctDNA具有广泛的临床应用价值，可用于肺癌靶向治疗致癌驱动基因(如鼠类肉瘤病毒癌基因、磷酸酶和张力蛋白同源物基因、表皮生长因子受体基因、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因等)的突变检测，以实现肿瘤的精准治疗。中国国家食品药品监督管理总局于2015年2月批准吉非替尼说明书更新，更新后的说明书指出在无法获得肿瘤组织时，可通过血液ctDNA检测表皮生长因子受体基因突变指导吉非替尼治疗[18]。研究表明，ctDNA(3 d)比组织样本(10～14 d)能更快得到驱动基因的检测结果，且取样方法简单并可重复取样，实现了疗效和耐药性的实时监测[19]。Xing等[20]对36例肺腺癌患者在使用奥希替尼治疗前后的ctDNA样本进行体细胞突变谱分析，发现ctDNA变化与治疗效果和预后显著相关 。一项针对纳武利尤单抗治疗晚期肺癌的研究证实，外周血中ctDNA浓度的降低预示疗效和预后较好[21]。另有研究表明，从ctDNA中检测驱动基因—表皮生长因子受体基因的突变丰度可反映表皮生长因子受体靶向药物的疗效和预后，且比癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶等常用生物标记物更敏感[22]。综上，ctDNA可指导肺癌治疗，用于疗效评价、耐药性检测和预后评估，在肺癌个体化治疗和全程管理中具有巨大优势。

3 外泌体

3.1 外泌体的概念及检测方法 外泌体可在血液、尿液、脑脊液、胸膜积液等多种体液中被检测到，是直径为30～100 nm的细胞外囊泡，由包括肿瘤细胞在内的多种细胞分泌产生，其主要功能是递送各种生物分子(蛋白质、DNA和RNA等)到靶细胞[23]。研究发现，肿瘤细胞分泌的外泌体可促进肿瘤的发生、发展和转移，促进肿瘤血管生成，参与肿瘤免疫调节和耐药性发生[24]。目前，基于外泌体的理化性质和生化特性，学者们开发了一系列分离技术，表3对其主要分离技术的优缺点进行了总结[25]。

表3 外泌体分离技术的优缺点比较

3.2 外泌体临床应用进展 肺癌的形成和发展受多种因素和机制影响，肺癌细胞分泌的外泌体作为细胞间信息传递的介质在这一过程中起着至关重要的作用[26]。外泌体富含多种与肺癌发生发展相关的蛋白，如表皮生长因子受体、鼠类肉瘤病毒癌基因蛋白、紧密连接蛋白和RAB蛋白家族等，这些蛋白可作为肺癌诊断的生物标志物[27]。大量研究发现，外泌体中蛋白质和RNA表达水平的改变与肿瘤进展显著相关，可作为评价肺癌预后的潜在生物标志物，进而指导临床治疗。Sandfeld-Paulsen等[28]的研究证实外泌体膜结合蛋白纽约食管鳞状细胞癌1、胎盘碱性磷酸酶、表皮生长因子受体、凋亡相关基因2相互作用蛋白X和上皮细胞黏附分子与肺癌患者总体生存时间显著相关。Liu等[29]的研究证实外泌体中微小RNA-10b-5p、微小RNA-23b-3p和微小RNA-21-5p水平与肺癌患者总体生存时间呈负相关。研究发现外泌体可干预肺癌的治疗效果，例如外泌体的微小RNA-1246可通过促进肺癌细胞增殖导致放疗抗性增加[30]，外泌体锌指E盒结合蛋白1 mRNA可诱导肺癌细胞化疗抗药性的产生[31]，外泌体微小RNA-21通过下调蛋白酪氨酸磷酸酶和程序性细胞死亡蛋白4的表达，激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路，参与肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的发生[32]。此外，外泌体还可以作为天然药物载体，例如用外泌体包裹紫杉醇制备的新型纳米制剂，在肺癌转移小鼠模型中被证实有显著治疗效果[33]。随着深入研究外泌体在肺癌发生发展中的生物学机制，将外泌体作为诊断和治疗肺癌的新手段具有广阔的前景。

4 循环RNA

循环RNA是指存在于血液或其他体液中的胞外RNA，包含mRNA、微小RNA、长链非编码RNA和其他类型RNA，由细胞主动分泌和/或细胞凋亡后释放产生。循环RNA参与肿瘤的发生发展，对肿瘤生长发挥促进或抑制作用。随着二代测序技术的发展，通过筛查肺癌患者与正常对照人群体液样本中差异表达的循环RNA，不仅可作为诊断/预后候选标记物，还可成为潜在的治疗靶点[34]。Luo等[35]发现长链非编码RNA H19在肺癌患者血浆中明显升高，可用于肺癌的辅助诊断。长链非编码RNA-MIR22HG被证实具有肿瘤抑制因子的作用，可作为肺癌新的治疗靶点[36]。目前针对肺癌特异性循环RNA筛查的基础实验和临床研究不断涌现，循环RNA在肺癌发生发展中的作用也逐渐被证实，循环RNA分子检测技术将会在肺癌诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。

5 小 结

液体活检在肺癌诊疗中发挥着巨大作用，可用于肺癌的早期诊断、驱动基因的检测、治疗方案的制定以及疗效和复发的监测，从根本上促进肿瘤精准医学的发展。液体活检是一项具有挑战性的新技术，随着研究地不断深入，越来越多的研究成果将有望实现成果转化，从而更好地为临床服务。为使液体活检能更广泛应用于临床，不仅需要提升检测技术的灵敏度和特异性、扩大临床试验规模，还需要建立相应的检测标准，建设规范的监管体系。