基于网络药理学预测红花治疗心肌缺血的作用机制▲

谢 巍 杨 妮 肖 萍 黄艳玲

(广西柳州市妇幼保健院药学部，柳州市 545001，电子邮箱：915007149@qq.com)

发生心肌缺血时由于心脏血液灌注量减少导致供氧降低，能量代谢异常，从而无法维持心脏正常的功能[1]。血压降低、冠状动脉阻塞、炎症、心瓣膜病、血黏度变化、心肌病变均会引发心肌缺血。临床上，西医对心肌缺血的治疗重在改善供血、降低耗氧以及提高心肌组织对低氧的耐受性[2-3]。中医将该病归属于“胸痹”范畴[4]，其主要病机为心脉痹阻，活血化瘀类中药常用于心肌缺血的治疗。红花为菊科植物，性辛、温，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛的功效，其主要的化学成分有黄酮类、甾体、酚酸类、双醇、木脂素、查尔酮、炔类、挥发油等[5]。现代药理研究表明，红花具有显著抗血栓、抗动脉粥样硬化、改善血流动力学的作用[6-7]，其主要活性成分为红花黄色素，能显著减轻控制性降压诱导的兔海马缺血缺氧性损伤，可能是通过抑制神经型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)蛋白的表达而发挥作用[8]。但是，中药发挥疗效具有多成分、多靶点的特点，因此红花抗心肌缺血的机制是多方面的，但现阶段缺乏对红花抗心肌缺血的药效成分及作用机制的整体认识。 因此，探讨红花治疗心肌缺血作用机制有十分重要的指导意义。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。其将疾病的治疗策略由一个靶点、一个药治疗转变为多个靶点、多种组分治疗，与中药治病“整体性、多靶点”的原则相符合。本文通过网络药理学的方法构建红花“成分-靶点-通路”网络，分析红花中有效成分治疗心肌缺血的作用机制，寻找关键作用分子和信号通路， 为进一步实验研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 红花活性成分和作用靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索红花的全部化学成分，再筛选口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18[9]的有效成分。进一步利用该平台查询有效成分的作用靶点，并将筛选出的靶点标准化为Swiss-Prot 号和相应的简称。

1.2 心肌缺血疾病相关靶基因的收集 利用GeneCards数据库平台(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)和OMIM数据库平台(https://omim.org/)，检索心肌缺血的相关靶基因。利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，将获得的基因信息标准化，删除无人类样本Uniprot ID的基因。

1.3 基因映射 将红花中有效成分靶点和心肌缺血的相关靶基因进行基因映射(利用XLS表格进行基因映射对比)，从而获取有效成分和疾病共同作用的靶基因；并用R3.5.0软件VennDiagram包绘制维恩图，确定共同作用的靶基因。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 将红花-心肌缺血共同作用靶点的基因上传至STRING平台(https://string db.org/) 构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络模型，最低相互作用阈值设为“medium confidence”(>0.4)，蛋白种属设置为“Homo sapiens”，其他参数保持默认设置，获得红花-心肌缺血的PPI网络。

1.5 网络构建分析 利用Cytoscape v3.6.0软件构建“化合物-靶点-通路”网络图，并计算网络拓扑参数，将信号通路富集数量前20 位的靶点与该通路中的蛋白构建“靶点-通路”可视化网络。在网络中与1个节点相互作用的数目用度值表示，参与的生物功能越多则度值越大，表明在网络中的重要性越大。

1.6 功能富集分析及通路富集分析 应用R 3.5.0软件的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等安装包进行基因本体(Gene Ontology,GO) 功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，将富集分析所预测的化学成分靶点(P≤0.05)进行可视化处理，进一步分析红花治疗心肌缺血的生物过程和信号通路，最终分别绘制 GO功能富集分析的条形图和 KEGG 富集分析的气泡图和通路分析图。

2 结 果

2.1 红花的药效成分及其作用靶点 共收集到红花活性化合物189个，筛选出OB≥30%和DL≥0.18的高活性化合物共22 个， 分别对应得到化合物的作用靶点共1 466个。以自由度值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，自由度值的大小即代表着在网络中的关联度，根据活性成分与作用靶点的关联度(设定度值为>1)进一步筛选。因在数据库中6个活性成分无作用靶点，最终筛选出 218个作用靶点。槲皮素(自由度=77)的作用靶点最多，其次为山柰酚(自由度=34)和木樨草素(自由度=28) 。在22个活性成分中有13个成分有2个或以上的靶点。见表1。

表1 红花 中22个高活性化合物

2.2 “红花-心肌缺血”共同靶点的筛选 共获得531个心肌缺血疾病相关靶点，将这531个疾病靶点与218个红花化学成分作用靶点相交集，获得红花-心肌缺血共同靶点39个，见图1。

图1 心肌缺血疾病相关靶点与红花有效成分作用靶点的维恩图

2.3 网络模型的构建 将39个红花-心肌缺血共同靶点构建网络模型(见图2)；结果显示，红花的13种药效成分协同作用于39个心肌缺血靶点，其中与槲皮素对应的靶点达31个，与山柰酚对应的靶点有13个，说明槲皮素可能起到潜在关键作用。每个靶点均有2个以上的成分协同作用，其中，8种潜在药效成分共同作用于过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)基因，10种潜在药效成分共同作用于前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)基因。

图2 “活性成分-作用靶点-相关疾病”网络模型

注：三角形代表中药红花，菱形代表靶点，黄色椭圆形代表成分，红色椭圆形代表心肌缺血疾病。

2.4 PPI分析 将39个红花-心肌缺点共同靶点构建PPI网络。该网络包括39个节点，292条连线；每一条连线表示有一种证据证明两个蛋白有互作关系；每一个节点表示一个蛋白，节点的颜色表示不同的连接证据；节点自由度的大小表示其在网络中的重要性。在此基础上筛选出30个关键节点(筛选标准：根据节点之间的连线多少进行筛选，筛选连线较多的30个节点为关键节点)，并绘制关键蛋白节点的条形图；自由度较高的节点依次为白细胞介素(interleukin,IL)-6、白蛋白(albumin,ALB)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、丝裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、体细胞细胞色素C(cytochrome c,somatic,CYCS)、MYC、NOS3、PPARG、Fos。见图3、图4。

图3 共同靶点PPI网络

图4 PPI网络关键蛋白节点条形图

2.5 GO 功能富集分析 对红花-心肌缺血的39个共同作用靶蛋白进行GO生物功能分析，确定对应的条目(P<0.05)， 绘制排名前20位的GO 条目，如图5所示，图中颜色越红，表明功能富集越密集。共同作用靶点主要富集在激活转录因子结合、雌激素受体结合、半胱氨酸型内肽酶活性、核激素受体结合、DNA结合转录激活活性/RNA聚合酶Ⅱ特异性等48个生物过程。这表明红花可通过调控激活转录因子结合及雌激素受体结合等方面治疗心肌缺血。见图5。

图5 GO功能富集分析条形图

2.6 KEGG通路分析 对红花-心肌缺血的39个共同作用靶蛋白进行KEGG通路富集分析，绘制排名前20位的KEGG气泡图(P≤0.05)，同时对筛选的核心通路加以注释。气泡图中颜色与大小取决于关联基因Count值和P值，红色节点越大信号通路的显著性就越高，说明该条信号通路的重要性越高。共同靶点主要富集于心肌缺血相关信号流体切应力和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症的年龄愤怒信号、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、乙型肝炎、南美锥虫病、人巨细胞病毒感染等114个通路，这提示红花通过作用于多条通路来治疗心肌缺血，且这些通路间存在着复杂的相互作用关系。见图6。

其中，IL-17通路由6个成员IL-17A～F组成，而IL-17受体家族由5个成员IL-17受体A～E组成。IL-17通路在自身免疫疾病的发病机制和癌症方面有重要的意义，因此以IL-17通路为例绘制KEGG通路分析图。由通路图可知，使用红花治疗心肌缺血，可通过影响IKKa蛋白、IkBa蛋白、细胞外调节蛋白激酶1/2、凋亡信号分子(Caspase-3)转录激活AP-1因子，进一步影响CCL2、趋化因子(C-X-C基序)配体[chemokine(C-X-C motif)ligand，CXCL1]1、CXCL12趋化因子、IL-6、Fos等因子的表达，从而调控IL-17通路。见图6、图7。

图6 KEGG通路富集气泡

注：X轴表示关联基因数占信号通路上总基因数的比例，Y轴表示通路名称。

图7 IL-17通路分析图

3 讨 论

心肌缺血是心脏供氧减少、心肌能量代谢不正常导致的一种病理状态。现代医学认为，心肌缺血是由于血压降低、主动脉供血减少或者冠状动脉阻塞导致的心脏供血减少，此外心瓣膜病、血黏度变化、心肌本身病变也会导致心肌缺血[10]。虽然目前对心肌缺血的认识不断增加，但药物治疗心肌缺血的作用机制尚不完全明确，故基于网络药理学预测红花单味中药在治疗心肌缺血中的作用机制和关键通路有重要意义。

本研究从网络药理学方法出发，在中药系统药理学数据库与分析平台收集了红花中22种活性高化合物和1 446个靶点。另一方面，采用GeneCards数据平台和OMIM数据库数据平台检索得到531个心肌缺血相关靶点，并将两者进行基因映射，获得 39个共同基因靶点，并在此基础上构建了PPI网络。 通过网络分析获得木酚素、6-羟基甲醇、黄芩素、槲皮素等13种药效成分，发现其协同作用于ESR1、PTGS1、PPARG、VEGFA、BCL2等39个心肌缺血靶点，这充分体现了中药“多疾病”“多成分”“多靶点”的理论基础。在“活性成分-作用靶点-相关疾病”网络模型中可以看出，槲皮素对应的心肌缺血靶点最多，说明红花中槲皮素在治疗心肌缺血方面可能起到了关键作用。而现代药理研究也表明，槲皮素及其代谢物具有显著抗氧化、抗炎作用[11]，并且能调控心房钠尿肽对心血管疾病产生影响[12]。进一步行GO功能富集分析 显示，红花治疗心肌缺血的基因功能主要体现在雌激素受体结合、激活转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性等方面；KEGG通路富集分析显示红花治疗肺癌可能的信号通路为波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症的年龄愤怒信号、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路。

本文通过网络药理学的方法，探索红花治疗心肌缺血潜在的关键靶基因及信号通路，或可为红花的后续研发提供新的思路与方法。但本研究所得的结果仍存在不足之处，因此，在后期研究中还需临床试验证实通过数据挖掘预测得到的药物作用和功能。其次，本研究在筛选OB和DL时也存在一些限制，仅选取了口服的药物。而目前随着药物的制剂研发飞速发展，红花提取物的注射剂已被广泛应用于临床。此外，在后期的新药预测和研发中，口服利用度较低的成分也需要引起我们的重视，可能潜在有更广泛的治疗作用[13]。