组织固定对下游基因和蛋白分子检测的影响

苟继周，李晓星，孙 炎，张鸿英，彭 程，赵 霞，孙宜康，喻 宏，罗伟仁

病理科保存了大量的甲醛固定石蜡包埋(formalin fixed and paraffin embedded, FFPE)组织，这些样本是发现生物分子标志物有价值的潜在资源。病理工作者通过FFPE组织样本获取患者的形态学、遗传学、蛋白质组学和表观遗传学信息，为临床医师提供与精准医学相关的信息[1-2]。然而，在组织处理过程中若未进行标准固定，则无法准确检测突变，因为从FFPE组织中提取的DNA是片段化的，可能含有序列假象，在肿瘤异质性的背景下，序列假象很难与真正的突变区分[3-5]。因此，要掌握甲醛固定过程是渗透、结合和交联三位一体理论，全面了解和认识FFPE标本对下游基因和蛋白分子检测的影响，在临床和科研工作中尽可能做到减少FFPE标本对下游检测的影响[6]。

1 FFPE标本对蛋白质检测的影响

影响蛋白质检测从“热缺血”就已经开始。在手术期间，为控制出血用血管钳夹住血管，组织的血液供应被切断，便发生缺氧、缺血和代谢应激，可能导致蛋白质降解而发生改变。一旦组织离体后，电解质缺乏、细胞代谢产物积累和温度变动等因素会影响生物分子水平的变化，包括潜在的蛋白质生物标志物，因此，冷缺血时间是决定组织是否适用于免疫检测的关键因素[7]。冷缺血对检测的影响还与所检测蛋白质生物特性有关。比如磷酸化位点和磷蛋白水平在5～20 min冷缺血后，就有显著改变[7]；而HER-2在延迟2～3 h后固定，FISH信号和免疫组化染色结果均会减弱。在工作中，发现同一例乳腺癌标本取材的组织块中，其中一块组织取材较大，肿瘤位于组织块中心，周围为大量致密的纤维结缔组织包绕(图1)；另一块组织取材较小(图2)。在实验条件相同的情况下用免疫组化染色检测HER-2表达情况，发现组织较大者为阴性(图3)，而组织较小者为阳性(图4)，分析原因可能是由于甲醛不能及时渗透到肿瘤组织所致。当然，不能排除肿瘤组织中HER-2表达的异质性。

一般而言，对于蛋白质组学的检测，在环境温度下固定6～24 h免疫组化染色效果最佳。与固定1天的病理标本相比，固定2天导致质谱光谱减少，固定4天后可识别的蛋白质更少。由此可见，更长时间固定明显影响检测结果。也就是说，随着组织在甲醛中固定时间的延长，许多抗原的表达逐渐丧失。此外，类似研究表明，组织在甲醛中固定3天后，有部分抗原染色明显减少；固定7天后有更多的抗原丢失；固定14天后大多数抗原无法检测到[7]。

大多数蛋白质含有蛋白质翻译后修饰(PTM)，如糖基化、磷酸化和硫酸化等等。其中蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能最基本、也是最重要的机制。然而，磷酸化蛋白质很不稳定，可在冷缺血时间30 min内发生降解。有一些磷酸化蛋白质(如p-AKT、p-ERK1/2、p-Tyrosine和p-MET等)相当不稳定，在冷缺血1～2 h内抗原性会丧失。大多数磷蛋白随着固定时间的增加，表位丢失趋势明显。当然，有一些磷酸表位(如p-JAK2和p-ER)仍然可以在辅助诊断中常规使用[8]。

2 FFPE标本对DNA检测的影响

甲醛固定对DNA会造成损伤，其损伤的类型有：甲醛会引起DNA碱基与附近组蛋白的交联、DNA片段化、胞嘧啶碱基脱氨基，导致C->T突变以及脱碱基的产生等[3,9-10]。其中，DNA碱基与附近组蛋白的交联是甲醛固定中DNA损伤的主要形式，会引起DNA的构象变化，降低双链DNA的稳定性而导致DNA部分变性。

随着蜡块储存时间的延长和组织固定中甲醛pH值的降低，组织中DNA的断裂增加，DNA片段化增多[3]。FFPE中DNA的片段化对基因检测的影响主要有：(1)直接减少了可用于PCR扩增的模板量；(2)通过降低Taq DNA聚合酶的保真性导致扩增后DNA序列假象；(3)降低PCR的扩增效率引起PCR检测失败[11]。此外，DNA中的无碱基位点使双螺旋结构极其不稳定，导致DNA的局部变性[3]。

①A①B②A②B③④

图1较大块乳腺癌组织：A.乳腺癌组织HE染色；B.A图方框中的高倍图图2较小块乳腺癌组织：A.乳腺癌组织HE染色；B.A图方框中的高倍图图3HER-2在大块乳腺癌组织中呈阴性，EliVision法图4HER-2在小块乳腺癌组织中呈阳性，EliVision法

现有文献表明，死后间隔时间、冷缺血、样本大小、脱钙方法、固定方法均可影响FFPE标本中DNA的分析。其中固定方法包括是否使用缓冲甲醛、固定时间和温度以及是否使用超声波或微波辐射加速甲醛的组织渗透。尽管有以上这些因素影响DNA分析，在实际工作中，只要按照标准程序进行固定和保存，手术切除和活检标本中均能提取足够数量和高质量的DNA用于NGS测序[10]。

3 FFPE标本对RNA检测的影响

美国国家癌症研究所进行了生物样本预分析变量的研究，以确定甲醛固定和延迟固定对核酸分析的影响。通过对固定于不同延迟时间FFPE样本和匹配快速冷冻样本进行全转录组测序及小RNA的分析，发现与快速冷冻样本相比，甲醛固定改变了RNA-seq捕获的大多数基因内含子、外显子、未翻译RNA的相对比例[12]。

RNA质量主要通过以下三种方法评估：RNA完整性编号(RIN)、DV200(评估超过200个核苷酸的RNA片段的百分比)和基于qRT-PCR的系统(通过核苷酸长度的比值分析来评估质量)。采用DV200和qRT-PCR系统评估发现：长时间固定于甲醛(72h)可显著降低RNA质量。但是，通过RIN值并没有发现RNA片段化的这些差异，提示需要注意用RIN作为FFPE质量度量的有效性问题。与术中快速冷冻相比，FFPE对RNA质量具有显著影响[13]。

文献表明，延迟固定和脱钙方法可影响FFPE中特异性标志物RNA的完整性。影响RNA检测的固定方法包括固定液是否为缓冲液、固定温度和持续时间以及加速甲醛渗透到组织中的方法。就RNA分析可接受的固定持续时间而言，大多数研究认为8～48 h适合于ISH和qRT-PCR分析，但延长固定时间对RNA分析是不利的。然而，对于固定持续时间较短(6 h)是否影响检测存在一些分歧。与环境温度固定相比，37 ℃固定可导致RNA质量较差，4 ℃固定是否优于或相当于与室温固定的研究并不一致。

4 FFPE标本对miRNA检测的影响

miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。通过与信使RNA(mRNA)的物理相互作用抑制基因表达，广泛参与调节健康或疾病状态中细胞的功能，单个miRNA能够调节数百种mRNA。FFPE标本检测miRNA尽管不作为常规用于临床诊断，但由于组织原位分析miRNA的特性与组织学诊断疾病直接相关，有望作为形态学、蛋白质表达、转录谱和DNA序列分析有益补充，成为临床医师和病理学家的重要辅助手段。因此，对组织中miRNA的分析不仅可以发现与特定疾病状态相关的信息，还可能会成为预测患者预后的标志物[14]。

与其他核酸相比，miRNA比较稳健，能更好地耐受固定的影响以及抵抗常规处理和储存条件[14]。在甲醛中固定2～3天，miRNA均始终能检测到，但与配对术中快速冷冻对照相比，在延迟12 h后固定显示出增加的变化[13]。另外研究发现，与配对冷冻标本相比，甲醛固定后miRNA平均表达水平降低，随着固定时间延长至6天，这种影响变得更明显[14]，总之，标准化的甲醛固定时间是减少影响的前提条件。

由于肿瘤组织的异质性，肿瘤细胞周围有大量的间质细胞；仔细挑选肿瘤细胞群是组织中miRNA分析至关重要的环节[14]。研究表明，从FFPE样品中提取miRNA的方法学研究是可行的。miRNA的长度和高稳定性使其具有抗降解能力，可以从长达7～10年的FFPE样品中有效提取，结果与新鲜冷冻组织相当[14-15]。

5 对策与展望

综上所述，甲醛固定以不同方式不同程度影响组织的核酸、蛋白质和形态学的分析。因此，需要有相应的对策来指导组织标本的固定工作：(1)严格按照专家发布的共识要求进行病理组织标本的固定；(2)研发可以替代甲醛的组织固定液，避免由于甲醛固定引起的影响；(3)应用横波斑点成像等技术对甲醛固定过程进行实时监测，量化组织固定的程度，让组织固定更加规范化、统一化和标准化；此外，通过改进和优化检测的方法来避免甲醛固定引起的影响[16-17]。

在今后的工作中，根据《免疫组织化学检测技术共识》要求[18]，做好FFPE标本的固定处理，为下游基因和蛋白分子检测打好基础的同时，还应该大力研发和推广组织标本的实时监测技术。在不久的将来，精准组织固定仪器可能会应用到实际工作中，让组织标本固定更加规范化和标准化。